Virus del Herpes Simple 1 y 2

Clasificación

Características Generales y Epidemiología

Características básicas del virus del herpes simple

• Taxonomía:
  • Familia: Herpesviridae
  • Subfamilia: Alphaherpesvirinae
  • Género: Simplexvirus
• Virus de ADN
  • Doble cadena
  • Lineal
  • Codifica aproximadamente 70 proteínas
• Estructura:
  • Núcleo (contiene el genoma)
  • Nucleocápside icosaédrica
  • Tegumento (contiene proteínas y enzimas virales)
  • Envuelto y picos de glicoproteínas

Especies clínicamente relevantes

Se han reconocido dos tipos que causan infecciones:

• HSV-1 (tropismo por el epitelio oral)
• HSV-2 (tropismo por el epitelio genital)

Epidemiología

HSV-1:

• Prevalece en todo el mundo
• Afecta aproximadamente al 66% de la población
• Seroprevalencia:
  • Personas de 0 a 49 años de edad:
    • 47% en Estados Unidos
    • Hasta el 90% en los países de bajos ingresos
  • En los niños de Estados Unidos:
    • 6-7 años: 26%.
    • 12-13 años: 36%
• Sin preferencia de género
• Cada vez más frecuente como causa de herpes genital
• La causa más común de encefalitis viral aguda no epidémica en los Estados Unidos

HSV-2:

• Prevalece a nivel mundial
• Más común en los países de bajos ingresos
• Seroprevalencia:
  • Personas de 14 a 49 años en Estados Unidos: aproximadamente el 16%.
  • Aumenta con la edad y el número de parejas sexuales
  • Género:
    • Mujeres: 21%.
    • Hombres: 12%.
  • Raza:
    • Negros no hispanos: 39%
    • Blancos no hispanos: 12%.

Infección neonatal por herpes:

• Una complicación poco común de la infección por herpes genital materno
• Ocurre en aproximadamente 1 de cada 3.200 partos en Estados Unidos
• Es más probable que se produzca en mujeres que adquieren una infección primaria por herpes genital y, por tanto, carecen de anticuerpos maternos en el momento del parto o cerca de él

Patogénesis

Reservorio

Los humanos son el principal reservorio.

Transmisión

HSV-1:

• Contacto estrecho con secreciones orales de individuos que están eliminando activamente el virus
• También puede transmitirse a través de lesiones no aparentes o asintomáticas
• Puede transmitirse a través del sexo oral a parejas no infectadas

HSV-2:

• Contacto sexual:
  • El riesgo es mayor con las parejas de origen masculino que con las femeninas.
  • El 70% de las transmisiones exitosas se producen durante períodos de excreción viral asintomática.
• Contacto con secreciones infectadas
• Transmisión perinatal:
  • Suele ocurrir durante el parto vaginal
  • Las infeccionesen el útero pueden producirse durante infecciones primarias.

Fisiopatología

Infección primaria:

• Infección primaria:
  • Ocurre en individuos sin anticuerpos preexistentes contra el HSV-1 o el HSV-2
  • Diferente del primer episodio no primario: una infección herpética en un paciente con anticuerpos preexistentes contra el serotipo alternativo
  • Ejemplo: 1er episodio de una lesión perioral de HSV-1 en un paciente que tiene anticuerpos preexistentes contra el HSV-2
    • Los pacientes presentan síntomas y signos atenuados similares a los de las lesiones de reactivación, con menos lesiones y síntomas sistémicos menos graves.
• El virus debe encontrarse con superficies mucosas o piel rota (la piel intacta es resistente).
• El virus se adhiere a las células epiteliales y entra en ellas a través de las interacciones entre las glicoproteínas de la superficie viral y los receptores celulares del HSV (por ejemplo, la nectina-1).
• Se producen lesiones vesiculares de la epidermis → liberación de viriones infecciosos durante la fase lítica/reproductiva

Latencia de por vida:

• Definición: la persistencia de genomas virales en células que no producen virus infecciosos
• Las nucleocápsides virales son transportadas a lo largo de los axones sensoriales hasta los cuerpos celulares neuronales → establecimiento de la infección latente:
  • Ganglios del trigémino en las infecciones orofaríngeas
  • Ganglios sacros en las infecciones genitales
• El virus permanece latente en los núcleos de las células nerviosas.
• Sólo se sintetizan los transcritos de ARN viral asociados a la latencia (LAT) (no se producen proteínas virales).
• LATs parecen conferir resistencia a la apoptosis silenciando la expresión de genes líticos mediante la formación de heterocromatina, que impide la transcripción.
• El HSV evita el reconocimiento inmunitario celular y humoral mediante:
  • Inhibición de la vía de reconocimiento del CMH de clase I
  • Producción de receptores señuelo que se unen al dominio Fc de las Igs e inhiben la activación del complemento
  • Células dendríticas infectantes que ayudan en la respuesta inmune antiviral

Reactivación:

• Significa la transición de un virus de su estado latente al estado de replicación lítica en los ganglios nerviosos
• El virus se desplaza por transporte axonal anterógrado hasta las células epiteliales del lugar originalmente infectado.
• La replicación se produce dentro de las células epiteliales:
  • Formación de 1 o más grupos típicos de vesículas
  • También puede ser clínicamente inaparente e implicar el desprendimiento asintomático de viriones
• Las erupciones recurrentes suelen ser:
  • Menos grave
  • Ocurren con menos frecuencia a lo largo del tiempo
• Ocurre en individuos inmunocompetentes porque el HSV tiene múltiples mecanismos de evasión inmunológica
• Factores que favorecen la reactivación/frecuencia de reactivación:
  • Estados inmunodeprimidos:
    • Pacientes transplantados
    • Pacientes con cáncer
    • Pacientes con SIDA que tienen recuentos bajos de CD4 (el HSV requiere una inmunidad celular intacta para ser contenido normalmente)
  • Exceso de luz solar
  • Enfermedades febriles
  • Estrés físico (por ejemplo, procedimientos dentales) o emocional
  • Ancianos
  • Estímulos desconocidos

Patología

Los virus del herpes simple causan infecciones citolíticas que constituyen la base de todos los cambios patológicos: necrosis de las células infectadas junto con la respuesta inflamatoria

• Lesiones generales:
  • Vesículas agrupadas sobre una base eritematosa
  • Más tarde se convierten en pústulas y forman costras que curan sin cicatrizar porque los efectos citopáticos se limitan a la epidermis
• Microscópico:
  • Los queratinocitos infectados se vuelven multinucleados (por la fusión celular) y acantolíticos (separados entre sí).
  • Distintas inclusiones intranucleares («inclusiones Cowdry tipo A» = proteínas de replicación viral y viriones que empujan la cromatina hacia el borde del núcleo)
  • Necrosis epidérmica o acantólisis de espesor total (provoca ampollas)
  • Las ramificaciones nerviosas dérmicas pueden presentar una inflamación perineural aguda y crónica con hipertrofia ocasional de las células de Schwann y necrosis neuronal franca.

Enfermedades Causadas por el HSV-1

El HSV provoca una serie de afecciones. Las infecciones que se enumeran a continuación son las más comunes causadas por el HSV-1. Nota: El HSV-2 también puede estar asociado (aunque con menor frecuencia) a muchos de estos diagnósticos.

Infección asintomática

Sólo el 20%‒25% de los pacientes con anticuerpos contra el HSV-1 tienen una historia clínica positiva de infecciones orales-labiales o genitales.

Infecciones orales

Gingivoestomatitis:

• Comúnmente causada en niños por una infección primaria
• Signos y síntomas:
  • Fiebre
  • Lesiones vesiculares dolorosas:
    • Se producen en la mucosa oral y faríngea
    • Se ulceran rápidamente
  • Gingivitis con extensión a los labios y mejillas
  • Faringitis
  • Linfadenopatía cervical
  • Síntomas sistémicos:
    • Fiebre
    • Malestar
    • Mialgias

Faringitis:

• Causado comúnmente en adultos por una infección primaria
• Signos y síntomas:
  • Edema y dolor faríngeo
  • Exudado amigdalino
  • Lesiones orales:
    • Exudativa
    • Ulcerativa
  • Linfadenopatía cervical
  • Síntomas sistémicos

Herpes labial:

• Infección por reactivación recurrente
• Signos y síntomas:
  • Pródromo:
    • Aproximadamente 24 horas antes del brote, se desarrollan lesiones dolorosas en el borde del labio («borde bermellón»).
    • Dolor
    • Ardor
    • Hormigueo
    • Prurito
  • Lesiones:
    • Consiste en vesículas o úlceras bucolabiales localizadas («herpes labial» o «ampollas de fiebre»)
    • Disminución del dolor después de 24 horas
    • Cicatrización y formación de costras en 5-8 días
  • Rara vez se asocia con síntomas sistémicos

Infección genital

• Infecciones genitales primarias por HSV-1:
  • Úlceras genitales bilaterales
  • Linfadenopatía sensible
  • Fiebre
  • Cefalea
  • Mialgias
  • Disfunción autonómica (retención urinaria o estreñimiento)
  • Alteraciones sensoriales (hiperestesia o anestesia del periné)
• Reactivación del HSV-1 genital:
  • Más común en el primer año después de la infección
  • Múltiples recurrencias son poco comunes (a diferencia de las infecciones genitales por HSV-2).

Otras manifestaciones cutáneas

Panadizo herpético:

• Infección del dedo por inoculación del virus a través de una rotura en la piel
• Visto en:
  • Niños después de la autoinoculación
  • Adolescentes en asociación con HSV genital
  • Personal sanitario (dentistas, personal sanitario a domicilio)
• Signos y síntomas:
  • Vesículas individuales o en racimo:
    • Generalmente claro con base eritematosa → puede volverse turbio
    • Evoluciona hacia una úlcera poco profunda → costra
    • Se curan gradualmente en 2-3 semanas
  • Dolor por ardor u hormigueo
  • Pueden aparecer síntomas similares a los de la gripe.
  • Diferenciar de las infecciones bacterianas (paroniquia), ya que no se requiere una incisión quirúrgica.

Herpes gladiador:

• Infección de la piel de la cara, el cuello y los brazos de luchadores y jugadores de rugby
• Erupción vesiculopustulosa → ulceración

Eritema multiforme:

• Trastorno inmunológico
• Signos y síntomas:
  • Lesiones cutáneas
  • Eritema de la mucosa y erosiones o bullas (dolorosas)

Eczema herpético:

• Infección por HSV-1 superpuesta a lesiones cutáneas por dermatitis atópica (especialmente en pacientes con tratamiento inmunosupresor)
• Signos y síntomas:
  • Dolor y lesiones cutáneas vesiculares
  • Puede extenderse rápidamente si no se trata

Infecciones oculares

Las infecciones oculares se producen en <5% de los pacientes con infecciones por HSV-1, lo que conlleva la pérdida de visión y/o la ceguera.

Queratitis:

• Infección del epitelio corneal
• Principal causa de ceguera corneal en los países de altos ingresos
• Signos y síntomas:
  • Dolor
  • Sensación de cuerpo extraño
  • Desenfoque visual
  • Desgarro
  • Quemosis
  • Conjuntivitis
  • ↓ Sensación de la córnea
  • Lesiones dendríticas características de la córnea:
    • Úlcera corneal con patrón de ramificación
    • Visto en el examen con lámpara de hendidura
• Las infecciones recurrentes son frecuentes.
• Pueden producirse cicatrices estromales.

Necrosis retiniana aguda:

• Retinitis necrotizante, poco común y potencialmente cegadora
• Ocurre en:
  • Huéspedes inmunocompetentes
  • Mujeres embarazadas
  • Pacientes con infección por VIH
• Signos y síntomas:
  • ↓ Visión
  • Enrojecimiento ocular
  • Miodesopsias
  • Fotofobia
  • Algunos pacientes pueden tener dolor periorbital.

Conjuntivitis y blefaritis:

• Unilateral
• Vesículas en el margen del párpado
• Quemosis
• Edema de los párpados
• Desgarro

Coriorretinitis (uveítis posterior):

• De infecciones diseminadas por HSV
• Se observa en neonatos o en personas inmunodeprimidas
• Signos y síntomas:
  • Visión borrosa, distorsionada o pérdida de visión
  • Escotoma
  • Miodesopsias

Síndromes neurológicos

Encefalitis:

• Suele ser unilateral y afecta al lóbulo temporal y al córtex insular (pregunta de exámen)
• Alta tasa de morbilidad y mortalidad
• Signos y síntomas:
  • Fiebre
  • Cefalea
  • Convulsiones
  • Signos neurológicos focales
  • Conciencia alterada

Meningitis aséptica:

• Más comúnmente asociado a las infecciones por HSV-2
• Signos y síntomas:
  • Fiebre
  • Cefalea
  • Fotofobia
  • Meningismo

Otras manifestaciones:

• Parálisis de Bell: incapacidad temporal para controlar los músculos faciales del lado afectado de la cara
• Disfunción autonómica: se presenta como retención urinaria durante una infección genital primaria
• Mielitis transversal: una inflamación desmielinizante de ambos lados de 1 sección de la médula espinal

Infecciones de las vías respiratorias

Epiglotitis o laringitis (crup herpético):

• Puede ocurrir en niños
• Condición autolimitante
• Signos y síntomas:
  • Tos no productiva
  • Estridor

Neumonitis por HSV:

• Rara
• Suele ocurrir en pacientes inmunocomprometidos
• Se considera una condición definitoria del SIDA
• Se produce tras una traqueobronquitis
• Signos y síntomas:
  • Disnea
  • Tos
  • Fiebre
  • Sibilancias

Enfermedad gastrointestinal

Esofagitis por HSV:

• Suele observarse en huéspedes inmunocomprometidos
• Se considera una condición definitoria del SIDA
• Difundido por:
  • Extensión directa desde la orofaringe
  • Reactivación y propagación a través del nervio vago a la mucosa
• Signos y síntomas:
  • Odinofagia
  • Disfagia
  • Dolor torácico retroesternal

Hepatitis fulminante:

• Rara
• Asociado a la enfermedad diseminada
• Causado tanto por el HSV-1 como por el HSV-2
• Solo el 30% de los pacientes presentan lesiones cutáneas típicas.

Enfermedades Causadas por el HSV-2

Las afecciones que se enumeran a continuación son las más comúnmente asociadas a las infecciones por HSV-2. Una vez más, hay que tener en cuenta que el HSV-1 también puede estar asociado a muchos de estos diagnósticos.

Infección genital

Infecciones genitales primarias por HSV-2:

• Periodo medio de incubación: 4 días (rango 2-12 días)
• La viremia es más frecuente (24%) que en los casos de reactivación.
• Puede ser asintomática, o presentarse con síntomas leves o graves:
  • Úlceras genitales dolorosas:
    • Grupos de vesículas de 2-4 mm que contienen un líquido claro
    • Se convierten en pústulas que se rompen → erosiones o úlceras superficiales con bordes festoneados
    • Se curan sin cicatrizar
  • Disuria
  • Fiebre
  • Linfadenopatía inguinal local sensible
  • Cefalea

Infección no primaria de primer episodio (reactivación):

• Frecuencia de las recidivas:
  • Recaídas más tempranas y frecuentes si la infección primaria ha durado > 5 semanas
  • Más común con el HSV-2 que con el HSV-1
  • Más común en pacientes inmunodeprimidos
• Signos y síntomas:
  • Puede ser sintomático o asintomático
  • Pródromo: leves hormigueos o dolores punzantes en las nalgas, las piernas y las caderas
  • Menos lesiones y síntomas sistémicos menos graves

Manifestaciones extragenitales

• Meningitis aséptica
• Meningitis aséptica recurrente benigna (meningitis de Mollaret):
  • > 3 episodios de síntomas de meningitis
  • Seguido de una resolución espontánea
• Disfunción del SNA sacro: provoca retención de orina
• Radiculitis sacra:
  • Retención urinaria aguda con pérdida de la sensibilidad sacra
  • Se produce en infecciones primarias graves
  • Transitorio, pero requiere cateterismo
• Hepatitis
• Proctitis: más común en hombres que tienen sexo con hombres (HSH)

Diagnóstico

• PCR:
  • Método de diagnóstico preferido
  • Puede utilizarse para detectar ADN viral
  • Puede utilizarse para identificar los serotipos del HSV
  • Sensibilidad (98%) y especificidad (99%) extremadamente altas
  • Hallazgos positivos en el curso temprano de la enfermedad
  • Las muestras pueden obtenerse de:
    • Lesiones vesiculares no cubiertas
    • Líquido intraocular (necrosis retiniana aguda)
    • Hisopos uretrales, rectales o cervicales
    • LCR
    • Sangre (útil para infecciones neonatales fulminantes, hepatitis)
• Cultivos virales:
  • Menos sensible que la PCR
  • Depende de la cantidad de virus
• Biopsia de tejido:
  • Sitios:
    • Piel
    • Pulmón
    • Hígado
    • Esófago
  • Se puede diagnosticar por su aspecto histológico y confirmarse mediante métodos inmunohistoquímicos o moleculares
• El frotis de Tzanck:
  • Procedimiento:
    • La muestra se obtiene raspando la base de una vesícula.
    • La muestra se coloca en un portaobjetos.
    • Teñido con Giemsa o azul de toluidina
    • Se observan los efectos citopáticos típicos del HSV.
  • Mostrará células gigantes multinucleadas
  • Baja sensibilidad y especificidad
  • No se puede diferenciar entre los serotipos del HSV
• Prueba directa de anticuerpos fluorescentes:
  • Rápida
  • Baja sensibilidad y especificidad
• Pruebas serológicas:
  • Aplicaciones limitadas
  • Los títulos no se correlacionan con los cultivos positivos o la presencia de lesiones.

Tratamiento

Terapia médica

Antivirales:

• Mecanismo de acción: derivados nucleósidos que interfieren en la síntesis del ADN viral al inhibir la ADN polimerasa viral
• Debe vigilarse la función renal.
• Usos:
  • Depende de la gravedad (puede no ser necesario para infecciones leves o mínimamente sintomáticas)
  • Tratamiento de una infección activa
  • Terapia episódica (iniciada al primer signo de síntomas prodrómicos)
  • Supresión crónica (para recidivas frecuentes o graves)
  • Reduce pero no elimina la excreción viral
• Opciones sistémicas:
  • Aciclovir
  • Valaciclovir
  • Famciclovir
• Opciones tópicas (para infecciones oculares):
  • Aciclovir
  • Ganciclovir
  • Trifluridina (más toxicidad para la córnea)

Analgésicos:

• Lidocaína
• Benzocaína

Pacientes inmunodeprimidos

• Los pacientes inmunodeprimidos pueden presentar síntomas más graves, mayor riesgo de complicaciones y mayor riesgo de desarrollar infecciones por HSV resistentes a los medicamentos.
• Tratados con regímenes similares a los de los pacientes inmunocompetentes, pero con dosis más altas para la terapia supresiva
• Los pacientes seropositivos que no reciben terapia antirretroviral (TAR) pueden ser propensos a padecer el síndrome inflamatorio de reconstitución inmunitaria (SIRI) cuando son tratados por infecciones por HSV.
  • Las manifestaciones clínicas empeoran inicialmente tras el inicio de la terapia antirretroviral.
  • Se puede administrar una terapia supresora para prevenir el SIRI.

Prevención de nuevas infecciones por HSV

• Herpes labial:
  • Evite el contacto con la saliva o los fómites contaminados por la saliva de los miembros de la familia y las parejas íntimas (por ejemplo, evite besarse y compartir utensilios de cocina y toallas).
  • Personal sanitario:
    • Precauciones universales
    • Utilizar guantes durante la exploración física de un paciente con lesiones activas por HSV.
    • Protección ocular y bucal durante la aspiración o la broncoscopia
• Herpes genital:
  • Se recomienda el uso de barreras para el sexo oral y genital.
  • Nota: Las parejas embarazadas que son negativas al HSV deben tomar precauciones debido al alto riesgo de transmisión al neonato.
• Herpes gladiador:
  • Los deportistas no deben participar en deportes de contacto hasta que todas las lesiones herpéticas estén en la fase de corteza seca.
  • Se ha sugerido un tratamiento antiviral oral supresivo para todos los luchadores, independientemente de los antecedentes de HSV, ya que reduce notablemente el riesgo de un brote (en un 85%).

Comparación de los Herpesvirus

La tabla que se presenta a continuación compara y contrasta el HSV-1 y el HSV-2:

Comparación de los virus de la familia Herpesviridae

La siguiente tabla compara los 9 herpesvirus considerados endémicos en humanos. En total se conocen 115 especies diferentes de herpesvirus, que se agrupan en 3 familias:

• Alfa (infectan a las células epiteliales y producen una infección latente en las neuronas postmitóticas)
• Beta (infectar y producir una infección latente en varios tipos de células)
• Gamma (producen una infección latente principalmente en las células linfoides)

Diagnóstico Diferencial

• Úlceras aftosas recurrentes (aftas): una enfermedad muy común, probablemente relacionada con el sistema inmunológico, de la mucosa oral (y menos comúnmente, de la mucosa genital), que se manifiesta como pequeñas úlceras discretas y dolorosas que se curan en 1-2 semanas. Las aftas recurrentes no van precedidas de vesículas y sólo se producen en las superficies mucosas. El diagnóstico es clínico, aunque se pueden realizar pruebas para evaluar condiciones asociadas (por ejemplo, deficiencias nutricionales, enfermedad inflamatoria intestinal). El tratamiento incluye la evitación de los factores desencadenantes, la terapia sintomática y el tratamiento de las etiologías subyacentes.
• Sífilis: una infección bacteriana causada por la espiroqueta Treponema pallidum, que se suele contagiar por contacto sexual. La sífilis primaria puede presentarse con chancros duros que inicialmente se presentan como pequeñas manchas rojas. A diferencia de las vesículas en las infecciones por HSV, estos chancros (las vesículas están ausentes) son indoloros. El diagnóstico se realiza con serología, examen de campo oscuro e inmunotinción en la biopsia. La penicilina G es el antibiótico de elección.
• Chancroide: una ITS causada por Haemophilus ducreyi. Los pacientes desarrollan úlceras genitales necrotizantes dolorosas y linfadenopatía inguinal. El diagnóstico suele ser clínico, pero la PCR y los cultivos pueden utilizarse para la confirmación. El manejo es con antibióticos macrólidos.
• Otras úlceras genitales, anales o perianales: causas no infecciosas que no están relacionadas con las ITS: hongos, traumatismos, carcinoma, aftas, erupción fija por medicamentos y psoriasis.
• Faringitis bacteriana: infección de la faringe. Los pacientes suelen experimentar dolor de garganta y fiebre. Los síntomas no van precedidos de un grupo de vesículas agrupadas como las que se observan en las infecciones por HSV. El diagnóstico puede incluir pruebas rápidas de detección de Streptococcus del grupo A, cultivos bacterianos y PCR para excluir infecciones por HSV. El tratamiento incluye penicilina o amoxicilina.
• Infecciones por enterovirus (por ejemplo, herpangina): enfermedades febriles agudas causadas principalmente por los coxsackievirus A y B, y el enterovirus 71. La herpangina se asocia a pequeñas lesiones vesiculares o ulcerosas en las estructuras orofaríngeas posteriores (enantema). Los hallazgos clínicos y la PCR se utilizan para hacer el diagnóstico. El tratamiento es sintomático.
• Mononucleosis infecciosa: infección causada por otro herpesvirus, el VEB. Las manifestaciones clínicas incluyen fiebre, faringoamigdalitis y linfadenopatía. A diferencia de las infecciones por HSV, la mononucleosis no suele estar asociada a grupos de vesículas. El diagnóstico es clínico y se confirma mediante pruebas de anticuerpos heterófilos o serología. El tratamiento es de soporte.
• Síndrome de Stevens-Johnson (SJS): enfermedad rara y potencialmente letal que ataca la piel y las mucosas. El síndrome de Stevens-Johnson tiene un espectro con la forma más grave (necrólisis epidérmica tóxica (NET)) y puede ser desencadenado por una reacción a un medicamento o a una infección bacteriana o vírica (incluido el HSV) o enfermedad preexistente. Los pacientes presentan un pródromo gripal y la aparición de bullas cutáneas, seguidas de descamación en la cara, el tórax y las mucosas. El diagnóstico es clínico y el tratamiento es en gran medida de apoyo.
• Infecciones cutáneas bacterianas con ulceración superficial: infecciones que pueden simular un panadizo herpético. Las infecciones bacterianas de la piel con ulceración superficial no van precedidas de una vesícula y suelen afectar a los tejidos subepidérmicos. Es importante diferenciar estas condiciones, ya que los antibióticos y el drenaje no son necesarios para el panadizo herpético.
• Proctitis: además de las infecciones por HSV, el diagnóstico diferencial en los HSH incluye las infecciones por Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia y T. pallidum. La presentación de la proctitis puede simular una enfermedad intestinal inflamatoria. El diagnóstico se realiza mediante PCR, cultivos, serología, examen de campo oscuro e inmunotinción en la biopsia.