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Técnicas de Blotting

As técnicas de blotting envolvem a separação (via eletroforese) e a transferência de ADN, ARN ou proteínas para uma membrana de blotting. Esta separação é geralmente seguida pelo acoplamento do alvo a uma molécula marcada para deteção. O Southern blotting é usado para avaliar sequências de ADN específicas e pode ser usado na identificação de mutações genéticas e na medicina forense. O Northern blotting concentra-se nas sequências de ARN e é útil na avaliação da expressão génica. O Western blotting identifica proteínas e anticorpos e possui aplicações no diagnóstico de doenças infeciosas, alterações de proteínas (como na doença priónica) e condições autoimunes. Embora estes testes possuam uma boa especificidade, têm desvantagens significativas devido ao seu custo, ser trabalhoso e tempo de resposta lento.

Última atualização: 23 May, 2022

Responsibilidade editorial: Stanley Oiseth, Lindsay Jones, Evelin Maza

Visão Geral

Definição

Blotting é uma técnica de investigação usada para detetar e identificar macromoléculas, como os ácidos nucleicos e as proteínas. Esta técnica é realizada por:

  • Separação por eletroforese
  • Transferência para uma membrana
  • Deteção com uma sonda marcada

Tipos de blotting

Os 4 tipos básicos de blotting são

  • Southern
  • Northern
  • Western
  • Eastern (raramente usado em ambiente clínico)

Comparação das técnicas de blotting

Características do Southern, Northern e Western blot
Técnica Southern blot Northern blot Western blot
Alvo Sequências de ADN Sequências de RNA Proteína
Separação Eletroforese Eletroforese Eletroforese
Método de blotting Transferência capilar Transferência capilar Transferência eletroforética
Sonda Oligonucleotídeos Oligonucleotídeos Anticorpos
Métodos comuns de deteção
  • Raio-X
  • Colorimetria
  • Quimioluminescência
  • Raio-X
  • Colorimetria
  • Quimioluminescência
  • Colorimetria
  • Quimioluminescência

Eletroforese

Todas as técnicas de blotting usam eletroforese, que envolve o uso de um campo elétrico para separar as moléculas.

  • As moléculas são separadas por:
    • Tamanho
    • Carga elétrica
  • Usada extensivamente na análise de:
    • ADN
    • ARN
    • Proteínas
  • Tipos:
    • Cataforese: eletroforese de catiões
    • Anaforese: eletroforese de aniões
  • Técnica:
    • A amostra é depositada num gel.
    • O gel é colocado numa solução tampão.
    • Aplica-se um campo elétrico.
    • A corrente elétrica separa as moléculas.

Procedimento

Técnica geral de blotting

As técnicas de blotting seguem um procedimento geral:

  • A molécula alvo numa amostra é isolada.
  • A eletroforese separa as moléculas.
  • O conteúdo separado é transferido (ou blotted) para um filtro ou membrana para produzir uma “impressão”.
  • O filtro/membrana é então exposto a sondas radiomarcadas e incubado → a sonda liga-se à molécula alvo
  • A sonda e a molécula alvo criam bandas que podem ser visualizadas com filme de raios-X.
  • Observação: a sonda e os métodos de deteção também podem usar:
    • Colorimetria
    • Quimioluminescência

Southern blotting

  • São necessárias enzimas de restrição para clivar a amostra de ADN em fragmentos, antes da eletroforese
  • Antes do blotting, o ADN de fita dupla separado é desnaturado com solução alcalina → fragmentos de ADN de fita simples
  • Método de blotting: transferência capilar de ADN de um gel de eletroforese para um filtro
  • Usa sondas oligonucleotídicas marcadas que são complementares à sequência do ADN alvo
  • A incubação permite a hibridização da sonda com o ADN alvo.
Procedimento para southern blotting

Procedimento para o Southern blotting:
A: O ADN é clivado com enzimas de restrição e separado por eletroforese.
B: Os fragmentos de ADN são transferidos para um filtro de nitrocelulose.
C: O filtro é exposto a uma solução que contém uma sonda radiomarcada, permitindo a hibridização com sequências de ADN alvo.
D: As bandas no filtro são então expostas ao filme de raios-X para visualização.

Imagem por Lecturio.

Northern blotting

  • Método de transferência: transferência capilar de ARN de um gel de eletroforese para um filtro
  • Usa sondas oligonucleotídicas marcadas que são complementares à sequência de ARN alvo
  • A incubação permite a hibridização da sonda com o ARN alvo.

Western blotting

  • Às vezes, as proteínas da amostra precisam de ser desnaturadas antes da aplicação num gel de eletroforese.
  • Método de blotting: As proteínas são transferidas eletroforeticamente (usando um campo elétrico) do gel para a membrana de blotting.
  • Usa anticorpos específicos para a proteína alvo; este anticorpo pode ser:
    • Mais comum: não marcado (primário) → em caso afirmativo, é usado um anticorpo secundário marcado que pode ligar-se ao anticorpo primário
    • Menos comum: marcado
  • A incubação permite a formação de complexos anticorpo-antigénio.

Usos

Southern blot

  • Pode detetar:
    • Pequenas e grandes mutações de ADN:
      • Exclusões
      • Duplicações
      • Rearranjos
    • Alterações na metilação do gene
  • Aplicações:
    • Medicina forense
    • Identificação de novas mutações causadoras de doenças
    • Diagnóstico de doenças genéticas
    • Identificação de marcadores genéticos específicos de malignidade (e.g., fusão do gene BCR-ABL1 na LMC)

Northern blot

O Northern blotting pode ser usado para avaliar os níveis de ARN e a expressão génica.

Western blot

Identificação de anticorpos:

  • Diagnóstico de doenças infeciosas, incluindo:
    • HIV
    • Doença de Lyme
    • Infeções por Rickettsia
  • Identificação de proteínas e anticorpos anormais, incluindo:
    • Doença priónica
    • Distrofia muscular (análise da distrofina)
    • Autoanticorpos (e.g., anticorpos antimembrana basal glomerular (MBG))

Vantagens e Desvantagens

Vantagens

  • Geral: boa especificidade
  • Southern blot: pode detetar uma grande variedade de mutações
  • Western blot:
    • Boa sensibilidade
    • Pode avaliar várias proteínas alvo

Desvantagens gerais

  • Requer uma grande quantidade de ADN ou ARN
  • Processo lento e trabalhoso
  • Caro
  • O uso de materiais radioativos pode ser potencialmente perigoso.

Referências

  1. Kevil, C. G., Walsh, L., Laroux, F. S., Kalogeris, T., Grisham, M. B., Alexander, J. S. (1997). An improved, rapid Northern protocol. Biochem Biophys Res Comm 238:277–279.
  2. Steiling, K., Christenson, S. (2021). Tools for genetics and genomics: gene expression profiling. UpToDate. Retrieved December 29, 2021, from https://www.uptodate.com/contents/tools-for-genetics-and-genomics-gene-expression-profiling
  3. Schrijver, I., Zehnder, J.L. (2021). Tools for genetics and genomics: Cytogenetics and molecular genetics. UpToDate. Retrieved December 29, 2021, from https://www.uptodate.com/contents/tools-for-genetics-and-genomics-cytogenetics-and-molecular-genetics
  4. Gottlieb, G.S. (2019). Clinical manifestations and diagnosis of HIV-2 infection. UpToDate. Retrieved December 29, 2021, from https://www.uptodate.com/contents/clinical-manifestations-and-diagnosis-of-hiv-2-infection
  5. Hu, L. (2021). Diagnosis of Lyme disease. UpToDate. Retrieved December 29, 2021, from https://www.uptodate.com/contents/diagnosis-of-lyme-disease
  6. Mitschka, S., Mayr, C. (2020). Northern blot protocol. Retrieved December 29, 2021, from https://www.protocols.io/view/northern-blot-protocol-bqqymvxw
  7. Gavini, K., Parameshwaran, K. (2021). Western blot. StatPearls. Retrieved December 29, 2021, from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK542290/
  8. Tomar, M. (2016). Types of blotting. Res Rev J Pharmaceutics Nanotechnol. https://www.rroij.com/open-access/types-of-blotting-.php?aid=79704

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