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Técnicas de Transferencia

Las técnicas de transferencia implican la separación (mediante electroforesis) y la transferencia de ADN, ARN o proteínas a una membrana de transferencia. Esta separación generalmente va seguida de la formación de complejos de la sustancia diana con una molécula marcada para la detección. La técnica de Southern blot se usa para evaluar secuencias de ADN específicas y se puede usar en la identificación de mutaciones genéticas y en medicina forense. La técnica de Northern blot se centra en las secuencias de ARN y es útil para evaluar la expresión génica. La técnica de Western blot identifica proteínas y anticuerpos y tiene aplicaciones en el diagnóstico de enfermedades infecciosas, anormalidades de proteínas (como la enfermedad por priones) y afecciones autoinmunes. Aunque estas pruebas tienen una buena especificidad, tienen desventajas significativas debido a su alto costo, ser procesos laboriosos y tener un tiempo de respuesta lento.

Última actualización: 25 May, 2022

Responsabilidad editorial: Stanley Oiseth, Lindsay Jones, Evelin Maza

Descripción General

Definición

La transferencia es una técnica de investigación utilizada para detectar e identificar macromoléculas, como ácidos nucleicos y proteínas. Esta técnica se logra mediante:

  • Separación mediante electroforesis
  • Transferencia a una membrana
  • Detección con una sonda marcada

Tipos de transferencia

Los 4 tipos básicos de transferencia son

  • Southern
  • Northern
  • Western
  • Eastern (rara vez se usa en entornos clínicos)

Comparación de técnicas de transferencia

Características de las técnicas de transferencia Southern, Northern y Western
Técnica Southern blot Northern blot Western blot
Diana Secuencias de ADN Secuencias de ARN Proteínas
Separación Electroforesis Electroforesis Electroforesis
Método de transferencia Transferencia capilar Transferencia capilar Transferencia electroforética
Sonda Oligonucleótidos Oligonucleótidos Anticuerpos
Métodos de detección comunes
  • Radiografía
  • Colorimetría
  • Quimioluminiscencia
  • Radiografía
  • Colorimetría
  • Quimioluminiscencia
  • Colorimetría
  • Quimioluminiscencia

Electroforesis

Todas las técnicas de transferencia utilizan electroforesis, que implica el uso de un campo eléctrico para separar moléculas.

  • Las moléculas son separadas según su:
    • Tamaño
    • Carga eléctrica
  • Se utiliza ampliamente en el análisis de:
    • ADN
    • ARN
    • Proteínas
  • Tipos:
    • Cataforesis: electroforesis de cationes
    • Anaforesis: electroforesis de aniones
  • Técnica:
    • La muestra se coloca en un gel.
    • El gel se coloca en una solución tampón.
    • Se aplica un campo eléctrico.
    • La corriente eléctrica separa las moléculas.

Procedimiento

Técnica general de transferencia

Las técnicas de transferencia siguen un procedimiento general:

  • Se aísla la molécula diana en una muestra.
  • La electroforesis separa las moléculas.
  • Los contenidos separados se transfieren a un filtro o membrana para producir una «impresión».
  • Luego, el filtro/membrana se expone a sondas radiomarcadas y se incuba → la sonda se une a la molécula diana
  • La sonda y la molécula diana crean bandas que se pueden visualizar con una película de rayos X.
  • Nota: los métodos de sonda y detección también pueden utilizar:
    • Colorimetría
    • Quimioluminiscencia

Técnica de Southern blot

  • Se necesitan enzimas de restricción para dividir la muestra de ADN en fragmentos antes de la electroforesis
  • Antes de la transferencia, el ADN bicatenario separado se desnaturaliza con una solución alcalina → fragmentos de ADN monocatenario
  • Método de transferencia: transferencia capilar de ADN desde un gel de electroforesis a un filtro
  • Utiliza sondas de oligonucleótidos marcadas que son complementarias a la secuencia de ADN diana
  • La incubación permite la hibridación de la sonda con el ADN diana.
Procedimiento para la transferencia de southern

Procedimiento para la técnica de Southern blot:
A: El ADN se escinde con enzimas de restricción y es separado mediante electroforesis.
B: Los fragmentos de ADN se transfieren a un filtro de nitrocelulosa.
C: El filtro se expone a una solución que contiene una sonda radiomarcada, lo que permite la hibridación con las secuencias de ADN diana.
D: Las bandas del filtro se exponen luego a una película de rayos X para su visualización.

Imagen por Lecturio.

Técnica de Northern blot

  • Método de transferencia: transferencia capilar de ARN de un gel de electroforesis a un filtro
  • Utiliza sondas de oligonucleótidos marcadas que son complementarias a la secuencia de ARN diana
  • La incubación permite la hibridación de la sonda con el ARN diana.

Técnica de Western blot

  • A veces, las proteínas de muestra deben desnaturalizarse antes de aplicarlas a un gel de electroforesis.
  • Método de transferencia: las proteínas se transfieren electroforéticamente (usando un campo eléctrico) desde el gel a la membrana de transferencia.
  • Utiliza anticuerpos que son específicos de la proteína diana; este anticuerpo puede ser:
    • Más común: no marcado (primario) → si es así, se usa un anticuerpo secundario marcado que puede unirse al anticuerpo primario
    • Menos común: marcado
  • La incubación permite que se formen complejos antígeno-anticuerpo.
Procedimientos de transferencia western

Procedimiento para la técnica de Western blot:
A: Las muestras de proteínas se cargan en un gel y se separan mediante electroforesis.
B: Las proteínas separadas se transfieren electroforéticamente a una membrana.
C: La membrana se incuba con un anticuerpo primario que es específico de la proteína diana, lo que permite la formación de complejos antígeno-anticuerpo.
D: La membrana se incuba de nuevo con anticuerpos secundarios marcados, que se unen a los anticuerpos primarios.
E: En este caso, se agrega un sustrato que interactúa con los marcadores, lo que permite la detección por quimioluminiscencia.
SDS-PAGE: electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (por sus siglas en inglés)

Imagen por Lecturio.
Transferencia de western de b. Burgdorferi

Técnica de Western blot de Borrelia burgdorferi:
A, B y C: controles positivos para anticuerpos monoclonales específicos
D y E: Individuos seropositivos para IgM
F: Control positivo
G: Control negativo
H: Control blanco (solución salina tamponada con fosfato)
MW: peso molecular (por sus siglas en inglés)

Imagen: “Western blotting of B. burgdorferi” por Department of Biomedicine and Biotecnology, Alcalá University, 28871 Alcalá de Henares, Spain. Licencia: CC BY 3.0

Usos

Southern blot

  • Puede detectar:
    • Pequeñas y grandes mutaciones de ADN:
      • Deleciones
      • Duplicaciones
      • Reordenamientos
    • Cambios en la metilación de genes
  • Aplicaciones:
    • Medicina forense
    • Identificar nuevas mutaciones causantes de enfermedades
    • Diagnóstico de afecciones genéticas
    • Identificación de marcadores genéticos específicos de malignidad (e.g., fusión del gen BCR-ABL1 en la leucemia mieloide crónica)

Northern blot

La northern blot se puede utilizar para evaluar los niveles de ARN y la expresión génica.

Western blot

Identificación de anticuerpos:

  • Diagnóstico de enfermedades infecciosas, incluyendo:
    • VIH
    • Enfermedad de Lyme
    • Infecciones por Rickettsia
  • Identificación de proteínas y anticuerpos anormales, que incluyen:
    • Enfermedades por priones
    • Distrofia muscular (análisis de distrofina)
    • Autoanticuerpos (e.g., anticuerpos contra la membrana basal glomerular)

Ventajas y Desventajas

Ventajas

  • General: buena especificidad
  • Southern blot: puede detectar una amplia variedad de mutaciones
  • Western blot:
    • Buena sensibilidad
    • Puede evaluar varias proteínas diana

Desventajas generales

  • Requieren una gran cantidad de ADN o ARN
  • Proceso lento y laborioso
  • Costoso
  • El uso de materiales radiactivos puede ser potencialmente peligroso.

Referencias

  1. Kevil, C. G., Walsh, L., Laroux, F. S., Kalogeris, T., Grisham, M. B., Alexander, J. S. (1997). An improved, rapid Northern protocol. Biochem Biophys Res Comm 238:277–279.
  2. Steiling, K., Christenson, S. (2021). Tools for genetics and genomics: gene expression profiling. UpToDate. Retrieved December 29, 2021, from https://www.uptodate.com/contents/tools-for-genetics-and-genomics-gene-expression-profiling
  3. Schrijver, I., Zehnder, J.L. (2021). Tools for genetics and genomics: Cytogenetics and molecular genetics. UpToDate. Retrieved December 29, 2021, from https://www.uptodate.com/contents/tools-for-genetics-and-genomics-cytogenetics-and-molecular-genetics
  4. Gottlieb, G.S. (2019). Clinical manifestations and diagnosis of HIV-2 infection. UpToDate. Retrieved December 29, 2021, from https://www.uptodate.com/contents/clinical-manifestations-and-diagnosis-of-hiv-2-infection
  5. Hu, L. (2021). Diagnosis of Lyme disease. UpToDate. Retrieved December 29, 2021, from https://www.uptodate.com/contents/diagnosis-of-lyme-disease
  6. Mitschka, S., Mayr, C. (2020). Northern blot protocol. Retrieved December 29, 2021, from https://www.protocols.io/view/northern-blot-protocol-bqqymvxw
  7. Gavini, K., Parameshwaran, K. (2021). Western blot. StatPearls. Retrieved December 29, 2021, from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK542290/
  8. Tomar, M. (2016). Types of blotting. Res Rev J Pharmaceutics Nanotechnol. https://www.rroij.com/open-access/types-of-blotting-.php?aid=79704

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