Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

A reação em cadeia da polimerase (PCR, pela sigla em inglês) é uma técnica que amplifica exponencialmente fragmentos de DNA para análise. O processo é altamente específico, permitindo o uso de sequências específicas de genes alvo, mesmo com quantidades mínimas de amostra. A PCR divide-se em 3 fases, que se repetem em vários ciclos: desnaturação do DNA molde, associação de um primer específico às cadeias de DNA simples e síntese/alongamento das novas moléculas de DNA. A partir daí, o DNA pode ser visualizado com técnicas de análise, como a eletroforese em gel. A rapidez, o baixo custo, a facilidade de uso e a alta sensibilidade e especificidade tornaram esta técnica altamente útil para as ciências básicas e biomédicas. Esta tornou-se fundamental em muitos contextos, incluindo análise forense, diagnóstico de doenças infeciosas, diagnóstico e rastreio de anomalias genéticas.

Última atualização: Aug 2, 2022

Responsibilidade editorial: Stanley Oiseth, Lindsay Jones, Evelin Maza

Descrição Geral

Definição

A reação em cadeia da polimerase (PCR, pela sigla em inglês) é uma técnica que amplifica exponencialmente sequências de ácido desoxirribonucleico (DNA, pela sigla em inglês) alvo, sendo usada para diagnóstico, identificação de vírus e análise.

Componentes necessários

  • DNA molde (amostra com a sequência genómica)
  • Iniciadores (primers):
    • Oligonucleótidos que são cuidadosamente desenvolvidos para uma sequência alvo específica
    • Complementares à extremidade 3′ da região alvo
  • Bases de nucleótidos livres
  • DNA polimerase:
    • Deve ser termoestável para sobreviver a várias etapas de aquecimento/arrefecimento
    • Realiza a replicação

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Procedimento

Para amplificar o DNA ou o ácido ribonucleico (RNA, pela sigla em inglês), são repetidas em ciclos as seguintes etapas (geralmente até 30 a 40 vezes):

  • Desnaturação
  • Associação dos primers
  • Síntese

Desnaturação

  • A amostra é aquecida a aproximadamente 95°C (aproximadamente 203°F).
  • Há quebra das ligações de hidrogénio → separação das cadeias de DNA em cadeias isoladas
Pcr stage 1 denaturation

Etapa 1: Desnaturação
O DNA é desnaturado a altas temperaturas, causando a separação em cadeias simples.

Imagem por Lecturio.

Associação dos primers

  • A temperatura é reduzida para aproximadamente 50–65°C (aproximadamente 122–149°F).
  • Os primers ligam-se à extremidade 3′ das cadeias de DNA molde.
  • Segue-se a ligação da DNA polimerase.
Pcr stage 2 annealing of primers

Etapa 2: Associação dos primers
Os primers ligam-se à extremidade 3′ das cadeias de DNA molde após o arrefecimento da amostra.

Imagem por Lecturio.

Síntese/alongamento

  • A temperatura é aumentada para aproximadamente 70–72°C (aproximadamente 158–162°F).
  • A DNA polimerase é ativada → adiciona nucleótidos livres à extremidade 3′ dos primers
  • Criação de uma nova cadeia de DNA idêntica ao molde original
Pcr stage 3 synthesis

Etapa 3: Síntese/alongamento
A síntese do DNA é catalisada por uma DNA polimerase termoestável, que adiciona nucleótidos livres disponíveis complementares à cadeia molde de DNA, resultando numa molécula de DNA recém-sintetizada. O DNA é aquecido a 72°C (a temperatura ótima para a Taq DNA polimerase realizar a ampliação dos primers).

Imagem por Lecturio.

Repetição de ciclos

  • O DNA recém-formado serve como molde para outros ciclos de PCR.
  • Replicação exponencial de DNA segundo um fator 2X, onde x é o número de ciclos de replicação
  • O segmento de DNA alvo pode ser amplificado 105–106 vezes.

Análise

  • O segmento de DNA amplificado pode então ser observado com técnicas como a eletroforese em gel.
  • Os resultados devem ser comparados com ambos:
    • Controlo positivo
    • Controlo negativo

Variações

Existem muitas variações da técnica básica de PCR. Algumas das mais comuns incluem:

  • PCR de transcrição reversa (RT-PCR, pela sigla em inglês)
  • PCR quantitativo (qPCR, pela sigla em inglês)

RT-PCR

  • Utiliza RNA como molde
  • A transcriptase reversa é utilizada → cria uma cadeia de DNA complementar (DNA/RNA híbrido)
  • A porção de RNA é degradada pela transcriptase reversa ou ribonuclease H.
  • A DNA polimerase adiciona nucleótidos complementares à cadeia de DNA → molécula de DNA completa
  • O novo DNA torna-se o molde → segue-se o processo normal da PCR

qPCR

  • Também chamada de PCR em tempo real
  • Monitorização da amplificação, ao anexar:
    • Sonda fluorescente (específica da sequência)
    • Corante fluorescente (intercala com DNA)
  • Permite a deteção e visualização com software especializado
  • Útil para:
    • Quantificação (e.g., carga viral)
    • Deteção rápida de uma sequência alvo (sem exigir técnicas de análise pós-PCR)

Usos

Forense

  • A PCR permite a comparação de pequenas amostras de DNA de evidências de uma cena de crime com o DNA de suspeitos.
  • Teste de paternidade

Genotipagem e sequenciação

  • Identificação de mutações genéticas:
    • Permite o diagnóstico de muitas doenças genéticas
    • Pode ser realizada em células embrionárias para determinar se um embrião apresenta predisposição para o desenvolvimento de certas condições
    • Pode identificar portadores genéticos → útil para aconselhamento genético
  • O reconhecimento de oncogenes alterados pode permitir um tratamento alvo para o cancro.
  • Pode ser utilizada para tipagem de tecidos na implantação de órgãos

Doenças infeciosas

A PCR melhorou significativamente o potencial diagnóstico para doenças infeciosas.

  • Pode ajudar de forma rápida na identificação de microrganismos com:
    • Crescimento lento em cultura
    • Impossibilidade de realizar cultura
  • Exemplos:
    • VIH
    • HSV
    • SARS-CoV-2
    • Influenza
    • Mycobacterium
    • Borrelia burgdorferi
  • A qPCR permite a quantificação da carga microbiana (além da análise qualitativa).
  • Também pode ser utilizada para detetar genes que codificam resistência a antibióticos

Vantagens e Desvantagens

Vantagens

  • Rápida
  • Barata
  • Relativamente fácil de utilizar
  • Altamente específica
  • Sensível (é possível o uso em amostras muito pequenas)
  • Pode amplificar exponencialmente a replicação do DNA para criar um número quase infinito de cópias de DNA alvo
  • A máquina de PCR replica o DNA in vitro:
    • Sem necessidade de bactéria
    • Sem extração de DNA

Desvantagens

  • Extremamente sensível → propensa a erros de contaminação por RNA ou DNA
  • Os primers requerem dados de sequência (só podem ser utilizados para identificar a presença de um gene conhecido).
  • Potencial para os primers se associarem a outras sequências semelhantes → amplificação da sequência de genes errada
  • Formação de dímeros de primers:
    • Os primers hibridizam entre si através de bases complementares.
    • Resulta na amplificação do dímero ao invés da sequência alvo

Referências

  1. Fan, H, & Robetorye, RS. (2010). Real-time quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction. transcriptase-polymerase transcriptase-polymerase chain reaction. Methods Mol Biol. 630:199–213. http://reference.medscape.com/medline/abstract/20300999
  2. Brooks, GF CK, Butel, JS, Morse, SA, & Mietzneron, TA. Principles of diagnostic medical microbiology. In Brooks, GF CK, Butel, JS, Morse, SA, & Mietzneron, TA (Eds.), Jawetz, Melnick & Adelberg’s Medical Microbiology. New York: McGraw-Hill; 2010.
  3. Wittwer, CT, Herrmann, MG, Moss, AA, & Rasmussen, RP. (2013). Continuous fluorescence monitoring of rapid-cycle DNA amplification. Biotechniques. 54(6):314–20. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23905170/
  4. Ishmael, FT, & Stellato C. (2008). Principles and applications of a polymerase chain reaction: Basic science for the practicing physician. Ann Allergy Asthma Immunol. 101(4):437–43. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18939735/
  5. Smith, CJ, & Osborn, AM. (2009). Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology. FEMS Microbiol Ecol. 67(1):6-20. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19120456/
  6. Ghannam, MG., & Varacallo, M. (2021). Biochemistry, polymerase chain reaction. [Online] StatPearls. Retrieved December 5, 2021, from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK535453/
  7. Raby, BA. (2021). Tools for genetics and genomics: Polymerase chain reaction. In Tirnauer, JS (Ed.), UpToDate. Retrieved December 5, 2021, from https://www.uptodate.com/contents/tools-for-genetics-and-genomics-polymerase-chain-reaction
  8. National Human Genome Research Institute (2020). Polymerase chain reaction (PCR) fact sheet. National Institute of Health. Retrieved December 5, 2021, from https://www.genome.gov/about-genomics/fact-sheets/Polymerase-Chain-Reaction-Fact-Sheet

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