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Modificações Pós-transcricionais (Processamento de RNA)

As modificações pós-transcripcionais (PTMs, pela sigla em inglês) são processos que facilitam a produção de RNA maturado e funcional. Estes mecanismos regulatórios de resposta rápida permitem que diferentes proteínas sejam produzidas a partir de um gene e atuam como reguladores do fenótipo e da taxa de proliferação. Estas modificações também podem desempenhar um papel em algumas formas de cancro e em doenças neurodegenerativas. O RNA pré-mensageiro (mRNA), chamado RNA nuclear heterogéneo (hnRNA), é modificado pela adição de um cap 7-metillguanosina na extremidade 5' e uma cauda poli-A (poliadenilato) na extremidade 3' para estabilidade e proteção. Além disso, o hnRNA que contém intrões (sequências não codificantes) entre as sequências expressas, ou exões, sofre reparações (splicing). Este processo remove intrões para produzir um mRNA maturado com a sequência de codificação para tradução. O splicing alternativo, por outro lado, também exclui os intrões, mas formam-se várias combinações de exões, produzindo proteínas diferentes do mRNA original. Na edição de RNA, a sequência de mRNA é alterada e difere do modelo de DNA transcrito. O RNA transportador e o RNA ribossomal começam a partir de moléculas precursoras mais longas e passam por etapas que incluem metilação, cortes e adição de nucleótidos.

Última atualização: Jun 9, 2022

Responsibilidade editorial: Stanley Oiseth, Lindsay Jones, Evelin Maza

Descrição Geral

Transcrição

A informação genética do DNA é copiada para o RNA mensageiro (mRNA).

  • Neste processo, o mRNA é sintetizado do terminal 5′ para o terminal 3′.
  • A transcrição inicial é conhecida como RNA nuclear heterogéneo (hnRNA) ou pré-mRNA.
Expressão génica a partir do dna

A expressão génica do DNA, a sequência genética, é transcrita para RNA (transcrição):
A transcrição da informação genética é o primeiro passo na expressão génica e é o processo pelo qual uma região codificante do DNA (estrutura de dupla cadeia) é usada como modelo para a síntese de RNA mensageiro (mRNA). O mRNA maturado é traduzido em aminoácidos, formando proteínas (tradução) com a ajuda do RNA ribossomal e RNA de transferência (tRNA). Esta imagem mostra a transcrição sem modificações pós-transcritas do RNA.

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Modificações

As transcrições primárias, ou produtos imediatos da transcrição, sofrem alterações para se tornarem biologicamente funcionais.

  • mRNA:
    • Procariontes: A maioria dos mRNAs primários não tem modificações.
    • Eucariontes: O transcrito sintetizado de mRNA (ou hnRNA) é processado antes de sair do núcleo.
      • Adição do cap 5′
      • Adição da cauda 3′ de poli-A
      • Splicing
    • A modificação de hnRNA produz mRNA maturado, que é transportado para o citoplasma através de poros nucleares.
    • Em alguns casos, a edição de RNA ocorre com modificações de bases, criando uma sequência diferente daquela copiada do DNA.
    • Uma sequência diferente de mRNA produz uma proteína diferente; isto varia da velha hipótese de “um gene—um polipéptido”.
  • RNA de transferência (tRNA) e RNA ribossomal (rRNA):
    • Moléculas estruturais que não são traduzidas
    • Ambos têm pré-tRNA e pré-rRNA que sofrem processamento.
Resumo das modificações pós-transcricionais do hnrna

Resumo das modificações pós-transcricionais desde um hnRNA até um mRNA maduro:
A adição do cap 5′ e da cauda 3′ de poli-A e splicing (remoção das sequências intervenientes ou intrões)

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Adição do Cap 5′ e da Cauda 3′ de Poli-A

Cap 5′

7-Metilguanosina (resíduo de guanilil metilado) é adicionado à extremidade 5′ do hnRNA via:

  • Remoção do grupo fosfato da ponta no terminal 5′ por RNA trifosfatase
  • Transferência de monofosfato de guanosina (GMP pela sigla em inglês) do grupo trifosfato de guanosina pela guanilil transferase
  • Metilação da guanina pela guanina-7-metiltransferase (grupo metil de S-adenosilmetionina(SAM))

Funções:

  • Evita a degradação pela exonuclease
  • Sequência de reconhecimento para tradução

Cauda 3′ de Poli-A

50 a 250 resíduos de adenilil (AMP pela sigla em inglês) são adicionados à extremidade 3′ do hnRNA via:

  • Corte de cerca de 20 nucleótidos a jusante de uma sequência de reconhecimento AAUAA
  • Adição (e extensão até 250 nucleotídeos) de cauda de poli-A (gerada a partir de ATP) pela polimerase de poli-A

Função:

  • Evita a degradação no citosol por exoribonucleases 3′
  • Estabiliza o mRNA
Modificações pós-transcricionais de rna

Modificações pós-transcricionais do RNA:
As modificações do cap 5′ (7-metilguanosina) e da cauda 3′ de poli-A evitam a degradação do mRNA no citosol.

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Splicing Heterogéneo de RNA Nuclear

Exões e intrões

RNA heterogéneo nuclear (pré-mRNA) contém:

  • Secções codificantes chamadas exões (sequências expressas)
  • Secções não codificantes chamadas intrões (sequências intervenientes)

Processamento:

  • O hnRNA necessita de processamento (splicing) para produzir o mRNA com as devidas sequências de codificação.
  • Ocorre na maioria dos genes eucarióticos, mais frequentemente no mRNA
Exões e intrões pré-mrna com um resumo do splicing

Exões e intrões pré-mRNA com um resumo do splicing (de cima para baixo):
A transcrição pré-mRNA contém exões e intrões. O transcrito interage com pequenas ribonucleoproteínas nucleares e outras proteínas, formando um spliceossoma em certas junções do transcrito. São feitos cortes nos locais de splicing e o intrão é libertado. Após sofrer splicing, o RNA passa a ter apenas exões, que contêm a sequência de codificação.

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Splicing

  • Remoção de intrões do hnRNA/pré-mRNA, simultaneamente à ligação de exões, para formar mRNA maturado
  • O processo envolve hnRNA e componentes adicionais:
    • Pequenas ribonucleoproteínas nucleares (que são constituídas por pequenos RNA nucleares (snRNA) e proteínas)
    • Outras proteínas de ligação
  • Junções onde ocorre a reação de splicing:
    • Locais do splicing:
      • Áreas onde são feitos cortes entre o exão e o intrão
      • As sequências base identificam estes locais, um no lado 5′ (início do intrão) e o outro no lado 3′ (fim do intrão).
      • Sítio 5’/sítio do dador splicing: GU invariável
      • Sítio 3’/sítio do aceitador de splicing: AG invariável
    • Local da ramificação: localizado a montante do sítio 3′.
  • Mecanismo:
    1. Pequenas ribonucleoproteínas nucleares reconhecem os locais de splicing e o local da ramificação devido às sequências base no hnRNA.
    2. hnRNA, pequenas ribonucleoproteínas nucleares e outras proteínas combinam-se para formar o spliceossoma.
    3. O complexo spliceossoma faz um corte no local de splicing 5′ dador (ocorre através de um ataque nucleofílico por um resíduo de adenilil no local da ramificação).
    4. O agora livre terminal 5′ do intrão liga-se ao local da ramificação, formando uma estrutura em loop ou laço.
    5. O local de splicing 3′ é reconhecido, e o segundo corte ocorre lá. Segue-se a libertação do laço, e os 2 exões são unidos para formar o RNA maturado
  • Ocorre simultaneamente com o cap 5′ e as modificações da cauda 3′ de hnRNA
  • Patologias relacionadas:
    • β-talassémia:
      • Contém defeitos no splicing do mRNA do gene β-globulina
      • Mutações homozigóticas significativas (talassémia major) resultam em anemia dependente de transfusão
    • Atrofia muscular espinhal:
      • Falta de funcionamento do gene SMN1 devido a mutação
      • O SMN2 restante é incapaz de compensar devido ao defeito ao nível de splicing pré-MRNA (omissão do exão 7).
Aspetos técnicos do splicing

Aspetos técnicos do splicing:

Os pré-mRNA/hnRNA são compostos por exões e intrões. Pequenas ribonucleoproteínas nucleares + outras proteínas reconhecem o local da ramificação e as junções exão–intrão onde fazer o corte: o sítio dador 5′ (contendo a sequência GU invariável) e o sítio aceitador 3′ (contendo a sequência AG invariável). O transcrito de hnRNA + pequenas ribonucleoproteínas nucleares + outras proteínas combinam-se nestes locais e formam o spliceossoma.
Imagem de cima: Através da ajuda de pequenas ribonucleoproteínas nucleares (snRNPs), o primeiro corte é feito pelo resíduo adenilil (no local da ramificação) através de um ataque nucleofílico no local dador 5′.
Imagem do centro: O terminal 5′ livre forma então uma ligação com o local da ramificação (fazendo a estrutura em laço).
Imagem de baixo: O segundo corte é feito no local 3′ do intrão e os exões são unidos.

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Splicing alternativo

  • Splicing diferencial de uma sequência hnRNA
  • Mecanismos:
    • Os exões são seletivamente incluídos ou excluídos.
    • São utilizados locais alternativos de dadores 5′ ou aceitadores 3′.
    • Os locais de poliadenilação podem ser diferentes.
  • Até 95% dos genes multiexão sofrem splicing alternativo (SA) para codificar proteínas com diferentes funções celulares.
  • SA é uma etapa de regulação de resposta rápida necessária para uma síntese de proteínas aperfeiçoada, e assim determinar os fenótipos celulares e as taxas de proliferação.
  • Cerca de 15% das doenças hereditárias e cancros estão reportados como sendo associados ao SA.
  • Diferentes combinações de exões podem levar à criação de diferentes proteínas relacionadas a partir do mesmo hnRNA:
    • Moléculas de imunoglobulina (genes para cadeias pesadas possuem exões relacionados a subtipos individuais)
    • Variantes de tropomiosina no músculo
    • Recetores de dopamina no cérebro (recetores D2 com 2 isoformas)
Exemplos de splicing alternativo

Exemplos de splicing alternativo:
Proteína A: Exões 1-5 foram unidos após splicing de intrões.
Proteínas B e C: Um exão foi seletivamente excluído para formar uma proteína diferente.

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Edição de RNA

Geralmente, a sequência de DNA é refletida no mRNA maturado. A alteração da sequência ou edição do RNA é uma exceção.

Definição

  • Uma alteração na informação codificante após a transcrição resulta numa sequência de RNA diferente da sequência do seu DNA original.
  • Acredita-se que contribui para a regulação genética
  • Processos:
    • Mudanças de bases
    • Exclusão de bases
    • Inserções de bases

Mudanças de bases

Edição “C-para-U”:

  • Gene da apolipoproteína B(apoB): Os mesmos códigos genéticos para ApoB100 (sintetizado no fígado) e ApoB48 (sintetizado no intestino).
  • No intestino:
    • Desaminação da citosina (para uracilo) catalisada pela enzima citidina desaminase.
    • Codão CAA (citidina–adenina–adenina) (no mRNA) → UAA (uridina–adenina–adenina), um sinal de fim ou um codão de paragem
  • Como resultado desta edição:
    • ApoB100 é uma proteína de 100 kDa constituída por 4536 aminoácidos.
    • ApoB48 é uma proteína mais curta de 48 kDa constituída por 2152 aminoácidos.
    • A mudança produz ApoB48, que não tem o domínio C-terminal de ApoB100 (responsável pela ligação dos recetores LDL).

Edição “A-para-I”:

  • Afeta os substratos de RNA de cadeia dupla
  • Desaminação da adenina (a hipoxantina) catalisada por ADAR (adenosina desaminase que atua no RNA)
  • Adenosinas convertidas em inosinas, o que leva a substituições de bases A para G
  • Gera locais de splicing alternativo

Inserções/exclusões

  • Ocorre em tripanossomas e protozoários relacionados, afetando o mRNA mitocondrial
  • Envolve adição ou eliminação de uridina

RNA Ribossomal e Processamento de RNA de Transferência

RNA Ribossomal

  • Em procariontes:
    • Como estudado em Escherichia coli, existem 3 tipos de rRNA (5S, 16S e 23S) que têm transcrições primárias policistrónicas.
    • Processamento inicial da transcrição via clivagem endonucleolítica por RNases → pré-rRNA
    • As extremidades 5′ e 3′ do pré-RNA são então cortadas por outro conjunto de RNases.
    • A metilação ocorre durante a montagem de ribossomas para proteger contra a degradação.
  • Em eucariontes, a transcrição primária é uma grande molécula precursora 45S:
    • Contém moléculas de rRNA (28S, 18S e 5,8S) com sequências de distanciadoras no meio
    • Processado no nucléolo:
      • Por metilação em vários locais (facilitada por pequenos RNAs nucleolares (snoRNA))
      • Posteriormente, por corte do RNA
    • O quarto tipo de rRNA, 5S, é processado separadamente.
    • Os rRNA maturados resultantes, que se associam com outras proteínas, tornam-se o suporte das unidades ribossómicas no citoplasma.
  • Alguns rRNA eucarióticos têm intrões, e nesses, os rRNA pré-rRNAs fazem auto-splicing (agem como ribozimas).

RNA de transferência

  • O RNA de transferência é um polinucleótido único composto por uma média de 75 nucleótidos com características únicas:
    • Devido ao dobramento (folding) distinto, as extremidades 5′ e 3′ compõem o braço aceitador.
    • A extremidade 3′ também tem uma sequência CCA (citosina-citosina-adenina).
    • Tem bases modificadas como inosina, dihidrouridina, e pseudouridina
  • O precursor tRNA contém:
    • Nucleótidos extra nas extremidades 3′ e 5′.
    • Intrões
  • O processamento envolve:
    • A remoção dos nucleótidos e intrões extra
    • Modificação de bases padrão (como a metilação e a desaminação)
    • Utiliza RNase P (uma ribozima) para formar a extremidade 5′.
    • A adição de CCA no final da extremidade 3′ por tRNA nucleotidiltransferase
Rna de transferência (trna)

Estrutura secundária de RNA de transferência (tRNA). Note que toda a sua sequência pode ser vista, destacando o seu tamanho reduzido.

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Referências

  1. Helm M. (2006). Post-transcriptional nucleotide modification and alternative folding of RNA. Nucleic Acids Research 34(2):721–733. https://doi.org/10.1093/nar/gkj471
  2. Weil P. (2018). RNA synthesis, processing, & modification. Rodwell VW, Bender DA, Botham KM, Kennelly PJ, Weil P (Eds.), Harper’s Illustrated Biochemistry, 31st ed. New York: McGraw-Hill.
  3. Jiang W, Chen L. (2020). Alternative splicing: human disease and quantitative analysis from high-throughput sequencing. Computational and Structural Biotechnology Journal 19:183–195. https://doi.org/10.1016/j.csbj.2020.12.009
  4. Anna A, Monika G. (2018). Splicing mutations in human genetic disorders: examples, detection, and confirmation. Journal of Applied Genetics 59(3):253–268. https://doi.org/10.1007/s13353-018-0444-7

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