Etapas da Transcrição

Visão Geral da Expressão Genética

Definição

Dogma central: Para expressar um gene, o DNA é transcrito em RNA, sendo então traduzido numa proteína (ou num fragmento de proteína conhecido como polipéptido).

Transcrição é o processo pelo qual o DNA é usado como um modelo para fazer mRNA.

DNA

O DNA é uma molécula de dupla hélice composta por 2 cadeias antiparalelas. O DNA tem uma estrutura que se parece com uma escada entrelaçada.

• Os “lados” de cada escada:
  • São compostos por moléculas alternadas de desoxirribose (um açúcar de 5 carbonos) e de fosfato
  • As ligações de fosfodiester ligam o carbono 3′ num açúcar ao carbono 5′ no seguinte.
• Os “degraus” da escada são feitos de moléculas que contêm nitrogénio, chamadas nucleótidos, frequentemente apelidadas de “bases”.
• Pares de base do DNA:
  • Guanina (G), citosina (C), adenina (A), e timina (T)
  • G emparelha-se com C (e vice-versa) através de 3 pontes de hidrogénio.
  • A emparelha-se com T (e vice-versa) através de 2 pontes de hidrogénio.
  • Estes pares de base podem ser “lidos” como uma sequência de letras (por exemplo, GTATCGA).
  • Esta sequência de letras é o “código”, ou manual de instruções, usado, em última análise, para criar proteínas.
• Cadeias de DNA:
  • Devido à forma como os açúcares estão orientados, 1 cadeia vai na direção de 5′ → 3′ enquanto a outra vai na direção de 3′ → 5′.
  • Cadeia codificante: a cadeia que contém o código genético primário
  • Cadeia modelo:
    • A cadeia oposta à cadeia de codificação: contém os pares de bases “opostos” aos da cadeia codificante.
    • Esta é a cadeia que é lida durante a transcrição.
• Vincos:
  • A hélice de DNA é assimétrica à medida que roda.
  • Esta rotação cria vincos maiores e menores entre espirais.
  • O vinco principal é suficientemente largo para que muitas proteínas reguladoras se possam ligar diretamente ao DNA através desse espaço.
• O DNA é carregado negativamente (devido às moléculas de fosfato).

RNA

Estrutura geral:

• Uma molécula de cadeia simples composta por moléculas alternadas de ribose (um açúcar de 5-carbono) e fosfato
• Cada ribose está ligada a um nucleótido de RNA:
  • Guanina (G), citosina (C), adenina (A), e uracilo (U)
  • Note-se que ao invés de timina, A liga-se a U (e vice-versa) através de 2 pontes de hidrogénio.

Tipos de RNA:

• mRNA:
  • É criado durante a transcrição, a partir da cadeia modelo do DNA no núcleo.
  • Movimenta-se para o citosol para a tradução em polipéptidos por ribossomas
• rRNA: um componente dos complexos ribossómicos responsáveis pela síntese de proteínas
• tRNA: transporta aminoácidos para o ribossoma, onde eles se ligam ao mRNA, alinhando os aminoácidos que se ligarão para formar o polipéptido

Início da Transcrição

A transcrição começa numa região conhecida como promotora. Uma enzima chamada RNA polimerase lê a cadeia de DNA modelo e cria o mRNA. São necessárias proteínas adicionais, conhecidas como fatores de transcrição, para que a RNA polimerase se ligue à sequência promotora em eucariontes.

Sequências promotoras

Os promotores são regiões ricas em AT que sinalizam o ponto de partida para a transcrição:

• Normalmente, imediatamente a montante do gene alvo.
• O local de ligação para a polimerase do RNA
  • Requer múltiplos fatores de transcrição em eucariontes
  • Requer apenas fator sigma em procariontes
• Permite que a RNA polimerase determine qual é a cadeia codificante e qual é a cadeia modelo, com base na orientação da sequência
• Caixa TATA (TATA box): um promotor comum
  • As ligações A-T são mais fracas que as ligações G-C.
  • As regiões ricas em A-T separam-se mais facilmente, permitindo o acesso à cadeia modelo.
• Mutações no promotor levam a uma transcrição reduzida.

RNA polimerases

As RNA polimerases são enzimas que leem a cadeia modelo do DNA e criam a cadeia de mRNA correspondente. São compostas por várias subunidades.

Células procarióticas:

• Apenas têm 1 tipo de RNA polimerase
• Requerem apenas uma única proteína, conhecida como fator sigma, para se ligar à sequência promotora

Células eucarióticas:

• Existem 3 tipos:
  • A RNA polimerase I (pol I) sintetiza o rRNA.
  • A RNA polimerase II (pol II) sintetiza o mRNA.
  • A RNA polimerase III (pol III) sintetiza o tRNA.
• São necessários múltiplos fatores de transcrição que se ligam ao DNA na sequência promotora (o RNA pol II não se pode ligar ao ADN por si só).

Fatores de transcrição

Os fatores de transcrição (TF pela sigla em inglês) são proteínas que se ligam à região promotora e são necessários para que a RNA pol II se ligue ao DNA em eucariontes.

• Cada TF ajuda a regular a expressão génica.
• Fator de Transcrição TFIID:
  • Contém “TATA-box binding protein” (TBP)
  • Está entre os TF mais importantes necessários para montar o complexo de iniciação
• Complexo de iniciação: o complexo de fatores de transcrição e RNA pol II na sequência promotora
• Assim que o complexo de iniciação for montado no promotor, a transcrição pode começar.

Alongamento da Transcrição

Após a montagem do complexo de iniciação no promotor, o alongamento da transcrição pode começar. É nesta fase que o mRNA é criado.

• Ocorre dentro da bolha de transcrição
• Após a iniciação, os fatores de alongamento adicionais montam-se:
  • Proteínas adicionais que ajudam a “empurrar” a RNA pol II
  • Locais adicionais de regulação transcricional
• Os nucleótidos correspondentes são trazidos para a RNA polimerase:
  • São trazidos na forma de trifosfatos de nucleítidos: ATP, UTP, GTP, CTP
  • Estes nucleótidos “trazem a sua própria energia com eles”.
• A enzima constrói um novo filamento de mRNA ao criar ligações fosfodiéster entre estes nucleótidos.
• A RNA pol II lê o modelo de DNA de 3′ a 5′ → produz mRNA de 5′ a 3′
• O RNA sintetizado de acordo com regras de emparelhamento de base: as purinas emparelham-se com as pirimidinas:
  • Adenina (purina) ↔ uracilo (pirimidina)
  • Guanina (purina) ↔ citosina (pirimidina)
• Forma-se uma hélice temporária híbrida DNA-RNA.
• A RNA pol II continua até que uma sequência de finalização de DNA seja encontrada pela maquinaria de transcrição.

Finalização da Transcrição

Finalização independente de fatores

A finalização independente de fatores ocorre quando a maquinaria de transcrição atinge uma sequência de finalização.

• Primeiro vem um palíndromo rico em GC:
  • Faz com que o RNA recentemente produzido forme um par de base consigo mesmo, criando uma estrutura em gancho de cabelo (hairpin)
  • A estrutura em gancho começa a desestabilizar o complexo DNA-RNA.
• De seguida, vêm 4 ou mais uracilos sucessivos:
  • As ligações U-A são mais fracas que as ligações G-C
  • Estas ligações não conseguem manter o RNA no DNA → mRNA cai

Finalização dependente de Rho

• A proteína Rho liga-se à cauda do novo RNA
• Usando a energia da hidrólise do ATP, a proteína Rho “sobe” a cauda mais rapidamente do que o movimento da RNA polimerase e “alcança” a RNA polimerase no momento correto.
• Causa a dissociação do RNA e da RNA polimerase do DNA modelo
• Pode ocorrer em conjunto com a finalização causada pela sequência finalizadora

Modificação Pós-transcricional

Após o mRNA ser sintetizado em eucariontes, ele é modificado para evitar a degradação imediata. Estas modificações incluem splicing, adição de cabeças/caudas e poliadenilação.

Splicing

• Os intrões não codificantes são retirados por spliceossomas (complexos de ribonucleoproteínas enzimáticas)
• Múltiplas proteínas diferentes podem ser feitas a partir de um único gene com splicing diferencial

Adição de cabeças/caudas

Durante a adição de cabeças/caudas, uma guanosina metilada (m7G) é adicionada ao terminal 5′ do mRNA:

• Impede que o mRNA seja ligado a outras cadeias de RNA
• Protege o mRNA da degradação
• Promove a translocação do mRNA do núcleo para o citoplasma
• Facilita a ligação do mRNA ao ribossoma para iniciar a tradução

Poliadenilação

Durante a poliadenilação, uma cauda de moléculas de adenina é adicionada à extremidade 3′ do mRNA:

• É referido como “cauda de poliA”.
• Estabiliza o mRNA

Relevância Clínica

• Envenenamento por cogumelos chapéu da morte: Estes cogumelos contêm uma toxina chamada α-amantina, que inibe a função da RNA polimerase II. O envenenamento com α-amantin é fatal.
• Análogos nucleosídicos: inibidores competitivos dos nucleósidos, que causam a finalização do alongamento de uma cadeia nucleosídica quando incorporados pela polimerase: Os nucleósidos análogos são usados no tratamento do HIV (por exemplo, azidotimidina) e na quimioterapia.
• Regulação da Transcrição:Existem milhares de fatores de transcrição, cofatores e reguladores de cromatina envolvidos na regulação da transcrição. Existem muitas doenças associadas à regulação anormal da transcrição, incluindo cancro, doenças autoimunes, doenças neurológicas, doenças cardiovasculares e obesidade, por exemplo.