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Inmunoensayos

Los inmunoensayos son técnicas basadas en placas que pueden detectar y cuantificar muchos tipos de moléculas a través de reacciones anticuerpo-antígeno. Un inmunoensayo generalmente involucra un analito, un anticuerpo específico y marcadores. La clasificación de los inmunoensayos se basa en el tipo de marcador utilizado, que incluye enzimas (ELISA, por sus siglas en inglés), moléculas/trazadores emisores de luz (e.g., inmunoensayos de quimioluminiscencia y fluorescencia) e isótopos radiactivos (radioinmunoensayos). Estos inmunoensayos especializados son relativamente sensibles, específicos, económicos y rápidos, y se usan ampliamente en un entorno clínico. Los inmunoensayos se utilizan en el diagnóstico de enfermedades infecciosas, la identificación de marcadores tumorales, las pruebas de alergia y el control de los niveles de medicamentos.

Última actualización: 8 Jun, 2022

Responsabilidad editorial: Stanley Oiseth, Lindsay Jones, Evelin Maza

Descripción General

Definición

Los inmunoensayos son técnicas de ensayo basadas en placas diseñadas para detectar y cuantificar péptidos, proteínas, anticuerpos y hormonas. El elemento más crucial de la estrategia de detección es una reacción antígeno-anticuerpo altamente específica.

Componentes

  • Analito: la molécula de interés (antígeno)
  • Anticuerpo: cuidadosamente seleccionado para el analito específico
  • Marcadores:
    • Moléculas que tienen el potencial de conjugarse con el complejo antígeno-anticuerpo
    • Permiten la detección y cuantificación

Tipos de inmunoensayos

El tipo de marcador define el inmunoensayo que se está realizando:

  • Enzimas: Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA, por sus siglas en inglés)
  • Moléculas/trazadores especializados (junto con enzimas) que tienen la propiedad de emisión de luz:
    • Quimioluminiscencia
    • Inmunoensayo de fluorescencia
  • Isótopos radiactivos: radioinmunoensayo

Procedimiento

Proceso general

  • Se añade una muestra/analito a una placa.
  • Se añaden un anticuerpo y un marcador.
  • Se forma un complejo anticuerpo-antígeno.
  • En algunos ensayos se realiza un paso de lavado para eliminar los antígenos y anticuerpos no unidos.
  • Se agrega un sustrato, que reacciona con el marcador y da como resultado:
    • Cambio de color (ELISA)
    • Luminiscencia (quimioluminiscencia)
    • Fluorescencia
    • Emisión de radiación (radioinmunoensayo)
  • Se detectan cambios/señales para determinar la presencia/cantidad de antígeno en una muestra. Los métodos de detección pueden incluir:
    • Espectrometría (cambio de color)
    • Luminometría (emisión de luz)
    • Contador gamma (radiación)

Variantes de ELISA

Hay 4 tipos principales de ELISA, que son variaciones del proceso general de inmunoensayo:

  • ELISA directo:
    • La placa está recubierta con un antígeno.
    • Incubación con un anticuerpo específico marcado
  • ELISA indirecto:
    • La placa está recubierta con un antígeno.
    • Incubación con un anticuerpo primario no marcado (específico del antígeno)
    • Incubación de nuevo con un anticuerpo secundario marcado (específico del anticuerpo primario)
  • ELISA sándwich (el analito se “intercala” entre 2 capas de anticuerpos):
    • Se utiliza una placa recubierta de anticuerpos.
    • El antígeno analito se añade a la placa y se incuba.
    • Incubado de nuevo con un anticuerpo marcado
  • ELISA competitivo:
    • Se utiliza una placa recubierta de anticuerpos (se utiliza una placa recubierta de antígeno si se analiza un anticuerpo específico).
    • Se añade el antígeno (o anticuerpo) objetivo de la muestra.
    • Se añade el antígeno (o anticuerpo) diana marcado y luego se lava.
    • Nota: A diferencia de otros métodos ELISA, menos color/ausencia de color indica un resultado positivo.
Mecanismo de elisa directo

Mecanismo de ELISA directo: Se agrega un antígeno objetivo a una placa junto con anticuerpos marcados con enzimas específicos para ese antígeno. Después de la incubación, el exceso de anticuerpos no unidos se elimina mediante lavado y se agrega un sustrato. En presencia del marcador enzimático, se produce una reacción que da como resultado un cambio de color.

Imagen por Lecturio.
Mecanismo de elisa indirecto

Mecanismo de ELISA indirecto: Se agrega un antígeno diana a una placa recubierta con anticuerpos primarios. Después de la incubación se forma un complejo antígeno-anticuerpo. El exceso de anticuerpo se elimina mediante lavado y se agregan anticuerpos secundarios marcados con enzimas, que se unen al complejo anticuerpo-antígeno. El exceso de anticuerpos se elimina por lavado y se añade el sustrato. La presencia del marcador enzimático da como resultado un cambio de color.

Imagen por Lecturio.
Mecanismo de inmunoensayo sandwich

Mecanismo de inmunoensayo sándwich:
De izquierda a derecha: el antígeno del analito se agrega a una placa recubierta de anticuerpos. Los antígenos no unidos se eliminan mediante lavado y se agregan anticuerpos secundarios marcados con enzimas, que se unen a los antígenos. El exceso de anticuerpos marcados no unidos se elimina mediante lavado. Se añade el sustrato y se detecta/mide el cambio de color resultante.

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Mecanismo de elisa competitivo

Mecanismo de ELISA competitivo:
De izquierda a derecha: se agregan un antígeno objetivo y un antígeno marcado con enzima a una placa recubierta de anticuerpos. Los antígenos compiten por unirse a los anticuerpos. A continuación, se añade un sustrato y se detecta/mide el cambio de color subsiguiente. A diferencia de otras formas de inmunoensayos, menos cambio de color indica una mayor concentración del antígeno objetivo (ya que no contiene el marcador enzimático).

Imagen por Lecturio.

Usos

Los inmunoensayos tienen una amplia gama de aplicaciones clínicas. Los ejemplos enumerados a continuación no son todos ellos.

Enfermedades infecciosas

Los inmunoensayos se pueden utilizar para identificar directamente microorganismos (basados en antígenos o toxinas) o evaluar indirectamente los anticuerpos contra el agente infeccioso. Algunos ejemplos son:

  • Detección de microorganismos:
    • Legionella pneumophila
    • Escherichia coli (toxina)
    • Clostridioides difficile (toxina)
    • Hepatitis B
  • Detección de anticuerpos:
    • VIH
    • Virus del Nilo Occidental
    • Hepatitis C
    • Borrelia burgdorferi
    • Treponema pallidum

Detección y seguimiento del cáncer

Pueden utilizarse inmunoensayos para detectar marcadores tumorales. Ejemplos incluyen:

  • Antígeno prostático específico (PSA, por sus siglas en inglés)
  • Antígeno del cáncer-125
  • Alfafetoproteína
  • Antígeno carcinoembrionario

Pruebas de alergia

Los inmunoensayos se pueden utilizar para detectar anticuerpos IgE contra alérgenos específicos:

  • Resultado positivo:
    • Indica sensibilización a ese alérgeno
    • No indica necesariamente si ese individuo tendrá una respuesta clínica tras la exposición a ese antígeno
  • Resultado negativo:
    • No sugiere alergia al antígeno
    • No excluye completamente la alergia al antígeno (en particular, si hay un antecedente clínico sugestivo)

Medicamentos

La monitorización de medicamentos terapéuticos es una aplicación importante de los inmunoensayos. Los ejemplos incluyen el control de los niveles de medicamentos de:

  • Digoxina
  • Teofilina
  • Inmunosupresores (e.g., ácido micofenólico, ciclosporina)
  • Antibióticos (e.g., amikacina, vancomicina, gentamicina)

Otros usos diagnósticos

Las pruebas de laboratorio adicionales donde se pueden utilizar inmunoensayos incluyen:

  • Troponina I de alta sensibilidad
  • Función de la tiroides:
    • Hormona estimulante de la tiroides (TSH, por sus siglas en inglés)
    • Tiroxina libre (T4) y triyodotironina (T3)
  • Nutricional:
    • Folato
    • Vitamina B12
    • Ferritina
    • Vitamina D

Ventajas y Errores

Ventajas

Las ventajas dependen del tipo de inmunoensayo utilizado; sin embargo, en general, son:

  • Baratos
  • Sensibles
  • Específicos
  • Relativamente rápidos y convenientes

Fuentes de error

  • Reactividad cruzada (los anticuerpos reactivos se unen a moléculas que son similares al analito → resultados falsos positivos/falsamente elevados)
  • Los autoanticuerpos (anticuerpos endógenos, en lugar de anticuerpos reactivos) se unen al analito → resultados falsos negativos/falsamente bajos)
  • Anticuerpos antirreactivos (los anticuerpos endógenos se unen a los anticuerpos reactivos → resultados falsos positivos/falsamente elevados)

Referencias

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