Sanger Sequencing

00:00 Bevor wir uns damit beschäftigen, wie die Sequenzierung funktioniert, muss ich Ihnen noch eine weitere beteiligte Komponente vorstellen. Das sind Didesoxynukleotide.

00:11 Sie erinnern sich sicherlich daran, dass die freie OH-Gruppe am 3´Ende für die Synthese der DNA essentiell ist.

00:20 Verfügt die Ribose über keine 3´ OH-Gruppe, kann die DNA-Polymerase keine weiteren Nukleotide anfügen. Bei der Didesoxyribonukleinsäure fehlt diese freie 3´ OH-Gruppe, die für die Bindung neuer Nukleotide benötigt wird. Die DNA-Sequenzierung beruht auf einer DNA-Replikation in vitro.

00:49 Wir trennen die DNA auf und replizieren und vervielfältigen die Stränge, um deren Basenabfolge zu ermitteln. Die Replikation bricht immer dann ab, wenn ein Didesoxynukleotid eingebaut wird. Didesoxynukleotide gibt es für alle Nukleotide, also für As, Ts, Cs und Gs. Betrachten wir genauer was passiert, wenn wir all diese Nukleotide in einem Fläschchen haben und mit der Replikation beginnen.

01:29 Verschiedene Komponenten sind für die Replikation essentiell. Dazu gehören die DNA-Matrize, eine DNA-Polymerase und ein paar Primer.

01:41 Zudem benötigen wir normale Nukleotide sowie zusätzlich einige Didesoxynukleotide.

01:49 Bei der DNA-Sequenzierung verwenden wir vier verschiedene Fläschchen. Es handelt sich um eine enzymatische Methode.

01:54 In einem Fläschchen befinden sich alle notwendigen Komponenten und zusätzlich Didesoxy-As.

02:01 In einem anderen sind Didesoxy-Gs enthalten, in einem weiteren Didesoxy-Cs und in dem letzten befinden sich Didesoxy-Ts.

02:09 Die vier verschiedenen Reaktionen laufen gleichzeitig ab.

02:15 In dem Behälter, der Didesoxy-C enthält, endet die DNA-Replikation immer nachdem ein Didesoxynukleotid eingebaut wurde. In diesem Beispiel erhalten Sie drei unterschiedlich lange Fragmente. Bei einem endete die Synthese beim ersten G. Beim zweiten endete sie beim zweiten G.

02:42 Und so weiter und so fort. Letztendlich entstehen hunderte oder sogar tausende unterschiedlich lange Fragmente. Die Fragmentlänge wird dadurch bestimmt, wie weit die DNA-Polymerase bereits repliziert hat, bevor ein Didesoxynukleotid ohne 3´ OH-Gruppe eingefügt wurde.

03:01 Dieses führt zum Replikationsabbruch. Gleiches passiert in dem Reagenzglas mit den Didesoxy-Cs.

03:08 Durch Replikation entstehen Tausende Kopien. Einige Replikationen wurden früher beendet, andere später.

03:13 Das trifft auch auf die Didesoxy-As zu.

03:17 Das Gleiche läuft im vierten Behälter ab, in diesem enden dann alle Fragmente mit Ts.

03:23 Nun können wir die Fragmentlängen und Endungen untersuchen.

03:30 Zur Längenbestimmung führen wir eine Gelelektrophorese durch. Die vier Proben werden in vier verschiedenen Spuren der Gelelektrophorese aufgetragen.

03:44 Eine Spannung wird angelegt und die DNA-Fragmente wandern aufgrund ihrer negativen Ladung durch das Gel in Richtung des positiven Pols. Die Ergebnisse können im Gel ablesen werden.

03:56 Dafür müssen wir uns die Grundlage des Prozesses vor Augen führen. Die Spuren enthalten Fragmente, die auf G, C, A oder T enden. Die jeweiligen Positionen im Gel können wir ablesen.

04:10 Die kürzesten Fragmente wandern am weitesten. Die längsten Fragmente weniger weit.

04:17 Diejenigen, die sich am nächsten bei den Vertiefungen befinden, sind am 3´Ende des DNA-Strangs lokalisiert.

04:24 Wir können die Sequenz folgendermaßen ermitteln: Das erste Fragment befindet sich in der T-Spur.

04:29 Es handelt sich demnach um ein T. Anhand der Abfolge im Gel ist erkennbar, dass ein G folgt.

04:37 Aufgrund der Lokalisation in der G-Spur wissen wir, dass es sich um ein G handeln muss.

04:41 Als nächstes folgt ein C.

04:48 Und so weiter und so fort. Wir können die Basenabfolge im Gel bis zum Ende ablesen und erhalten eine bestimmte DNA-Sequenz. In dem Gel können allerdings nicht unendlich viele oder ewig lange Sequenzen untersucht werden.

05:01 Selbstverständlich kann die Laufstrecke im Gel nicht um die ganze Welt reichen.

05:08 Daher müssen wir die DNA in Fragmente zerlegen.

05:14 Diese enzymatische Methode ist ziemlich mühsam und es dauert relativ lange, all die kleinen DNA-Fragmente zu sequenzieren und zu ordnen, um die gesamte Genomsequenz zu ermitteln. Diese Technologie wurde mittlerweile automatisiert.

05:33 Das ist ein entscheidender Fortschritt. Wir können eine automatisierte DNA-Sequenzierung durchführen, die auf dem gleichen Prinzip beruht. Die DNA-Replikation wird mit Didesoxynukleotiden durchgeführt.

05:45 Diese werden allerdings alle in einem Fläschchen gemischt, sodass nur eine Reaktion stattfindet.

05:50 Didesoxy-A, Didesoxy-G, Didesoxy-C, Didesoxy-T und die regulären Nukleotide befinden sich in einem Behältnis.

05:59 Die Synthese wird ganz normal durchgeführt. In den meisten Fällen verwendet die DNA-Polymerase die richtigen Nukleotide. Ab und zu wird ein Didesoxynukleotid ohne 3´ OH-Gruppe eingebaut. Das führt zum Kettenabbruch. So erhalten wir Fragmente unterschiedlicher Länge.

06:16 Es handelt sich somit bei der automatisierten Sequenzierung um genau den gleichen Prozess. Hinzu kommt allerdings die Tatsache, dass wir die Didesoxynukleotide mit Floureszenzfarbstoffen markieren.

06:34 Für die vier verschiedenen Buchstaben verwenden wir vier verschiedene Farben.

06:39 Nun führen wir eine Kapillarelektrophorese in einem sehr kleinen Röhrchen durch.

06:49 Am Ende des Kapillarröhrchens werden die Nukleotidfragmente mit einem Laser bestrahlt.

06:56 Ein Computer ermittelt die Farbabfolge und übersetzt sie in eine DNA-Sequenz. Dieses Vorgehen ist weniger aufwändig und viel schneller und ermöglicht uns eine schnellere Sequenzierung des menschlichen Genoms, als die langsamere enzymatische Methode.

07:20 Eine automatisierte Methode, bei der allerdings weiterhin Enzyme verwendet werden. Auf diese Art und Weise sequenzieren wir heutzutage Genome.