Probes and Blotting Methods

00:01 Wie aber können wir uns letztendlich unsere DNA-Bibliotheken ansehen und sie verwenden? Wurde die DNA geklont, können wir mit ihrer Hilfe nach ähnlichen Genen in verschiedenen Organismen zu suchen.

00:19 Zu Beginn des Prozesses müssen Restriktionsendonuklease unsere DNA zerschneiden.

00:23 Wir setzen die DNA-Fragmente dann frei und trennen sie mit Hilfe der Elektrophorese auf.

00:31 Im Gel wird die DNA denaturiert, damit einzelsträngige DNA vorliegt.

00:39 Jetzt fragen wir uns, ob in dieser DNA-Bibliothek, bestehend aus Tausenden Fragmenten, die wir durch ein Gel haben laufen lassen, bestimmte Gene enthalten sind.

00:52 An dieser Stelle können wir anfangen, über verschiedene Methoden der Visualisierung zu sprechen.

00:59 In der letzten Vorlesung habe ich Ihnen erklärt, dass wir die DNA mit Lumineszenz-Farbstoffen markieren können und die DNA-Fragmenten darüber sichtbar machen können. Dadurch wird die gesamte DNA dargestellt.

01:13 Nun suchen oder sondieren wir nach bestimmten Sequenzen.

01:20 Die Technik heißt Southern Blot. Sie wurde nach dem Herrn Dr. Southern benannt.

01:25 Später werden Sie noch Western Blots und Northern Blots kennenlernen. Dabei hießen die Herren weder Northern oder Western. Es handelt sich um unterschiedliche Techniken mit dem gleichen Prinzip.

01:37 Beim Southern Blot hybridiseren DNA-Sonden mit spezifischen DNA-Abschnitten.

01:44 Diese Markierungen zeigen uns, ob die Sequenzen, nach denen wir suchen, in der DNA-Bibliothek enthalten sind.

01:54 Wir haben das Elektrophorese-Gel. Wie Sie wissen, werden Fragmente beim Wandern durch das Gel nach ihrer Größe aufgetrennt. Kleine wandern schneller, längere sind größer und können sich weniger gut durch das Gel bewegen, sodass sie langsamer wandern. Um die Fragmente sichtbar zu machen, übertragen wir sie auf eine Membran, ein Blotting-Papier. Diese drücken wir auf das Gel, wodurch eine Kopie der DNA auf der Membran entsteht.

02:25 Die DNA-Kopie auf unserem Papier hybridisieren wir nun mit einigen Sonden.

02:32 Mittlerweile kann man diese Sonden sogar bestellen. Suchen Sie nach dieser oder jener spezifischen Sequenz, können Sie die Sonde in einem Katalog finden und sich innerhalb eines Tages liefern lassen. Dann kann begonnen werden. Die Nitrocellulose-Membran, die geblottet wurde, befindet sich jetzt in einem versiegelten Behälter, da sie radioaktiv markierte DNA-Nukleotide enthält. Diese sollen hybridisieren. Schauen wir uns das an.

03:05 Hier haben wir eine Nahaufnahme unseres Gels und unserer hellgrünen DNA-Sonden, die nach bestimmten Sequenzen suchen.

03:14 Sie suchen nach komplementären Partner-Strängen, da wir die ursprüngliche DNA zuvor denaturiert haben.

03:19 Die Sonden binden an komplementäre Sequenzen.

03:26 Anschließend waschen wir das Gel ab. Dadurch verschwinden alle übrigen Sonden und wir können die gebundenen sichtbar machen.

03:33 Die Hybridisierung der radioaktiv markierten Nukleinsäuren mit der im Gel befindlichen Nukleinsäure ermöglicht es uns, diese darzustellen. Indem wir einen fotografischen Film über das radioaktive Gel legen, können wir einen Abdruck erstellen.

03:54 Den Abdruck können wir lesen und die relativen Längen der DNA-Fragmente mit ihren Markierungen erkennen.

04:03 Wir suchen nach einer speziellen Sequenz, dargestellt durch diesen grünen Punkt. Die Länge des markierten DNA-Stücks könnte zum Beispiel mit einer bestimmten Mutation assoziiert sein, die zur Krebsentstehung führt.

04:21 Southern Blotting ist somit eine großartige Methode, um DNA in einem Nitrocellulose-Gel zu identifizieren. Bei Northern und Western handelt es sich nicht um Namen von Wissenschaftlern.

04:36 Die Methoden werden nur so genannt, weil es bereits die Methode Southern gibt. Northern Blots werden verwendet, um messenger-RNA zu identifizieren. Auch hierfür werden radioaktive Nukleotid-Sonden verwendet.

04:47 Western Blotting wird hingegen für die Suche nach Proteinen benutzt.

04:54 Zum Einsatz kommen radioaktiv markierte Antikörper. Die Proteine wandern durch ein Elektrophorese-Gel. Größere wandern langsamer als kleinere.

05:05 Von den radioaktiv markierten Proteinen können wir dann einen Abbruch erstellen.

05:14 Das sind großartige Methoden, um Ergebnisse der Gelelektrophorese und des DNA-Fingerprintings sichtbar zu machen.