Molecular Cloning

00:00 Lassen Sie uns nun über Klonen sprechen. Was ist Klonen? Es geht nicht um Dolly, das geklonte Schaf. Es geht um kleine Teile der DNA.

00:08 Klonen war ursprünglich die einzige Möglichkeit, eine bestimmte DNA zu vervielfältigen oder mehr von einem DNA-Fragment herzustellen. Wir können beispielsweise klonen, um eine eine Genbibliothek zu erstellen. Das ist eine Sammlung geklonter DNA-Fragmente der gesamten DNA eines Organismus. Wir können zudem klonen, um Kopien eines bestimmten DNA-Fragments zu erstellen.

00:32 Es handelt sich allerdings um einen relativ langsamen Prozess.

00:35 Am Ende der Lektion werde ich Ihnen die Polymerase-Kettenreaktion vorstellen, die diesen Prozess beschleunigt.

00:38 Das molekulare Klonen beinhaltet die Isolierung des Gens, an dem wir interessiert sind, das Einfügung dieses Gens in ein bakterielles Genom und die anschließende Amplifikation durch bakterielle Zellteilung.

00:53 Die Zellteilung führt zur Produktion weitere Kopien der in das Plasmid oder in das bakterielle Chromosom eingefügten Gene. Wir haben ein Plasmid. Dieses Plasmid hat zwei oder drei besondere Eigenschaften. Zum einen benötigt es einen Replikationsursprung.

01:13 Andernfalls können wir keine Kopien davon erstellen. Hat es Replikationsursprung, müssen wir sicherstellen, dass es ein Antibiotikaresistenzgen enthält.

01:25 Außerdem brauchen wir ein Gen, dessen Expression zu einem bestimmten Phänotypen führt. Hier ist das Antibiotika-Gen rot, das Gen für den spezifischen Phänotyp ist gelb dargestellt. In unserem Beispiel betrachten wir das lacZ-Gen, das für das Enzym Beta-Galaktosidase kodiert.

01:46 Die Beta-Galaktosidase baut Laktose ab. Wenn dieses Gen funktionsfähig ist, kann die Beta-Galaktosidase arbeiten.

01:53 Ist das Gen nicht funktionsfähig, ist auch die Beta-Galaktosidase funktionsunfähig. Behalten Sie das im Hinterkopf.

01:58 Das Ampicillin-Resistenzgen ist der rote Abschnitt. Das Ampicillin-Resistenz-Gen ermöglicht dem Plasmid oder dem Bakterium, das dieses Plasmid enthält, auf einem Ampicillin-haltigen Medium zu wachsen.

02:12 Wir haben eine Restriktionsendonuklease, die spezifisch in der Mitte des lacZ-Gens schneidet. Das dient der Überprüfung, ob das Gen, das wir einfügen wollen, integriert wurde.

02:28 Das lacZ-Gen ist nun aufgetrennt. Wir können daraufhin die fremde DNA einfügen.

02:36 Diese bindet an das bakterielle Plasmid. So erhalten wir ein rekombinantes Plasmid.

02:46 Oder wir erhalten kein rekombinantes Plasmid, wenn es die DNA nicht bis dorthin geschafft hat.

02:51 Im letzten Fall würde ein funktionierendes Betagalaktosidase-Gen vorliegen. Bei erfolgreich eingefügter DNA ist das Gen hingegen durch den neuen DNA-Abschnitt unterbrochen. Jetzt müssen wir diese DNA in ein Bakterium verlagern, damit dieses sich vermehren kann. Dafür soll das Bakterium die Plasmide aus der Umwelt aufnehmen. Wir züchten die Bakterien in einer Schale.

03:18 Einige von ihnen haben das Plasmid aufgenommen. Einige nicht.

03:26 Einige haben ein Plasmid aufgenommen, in das die entsprechende DNA nicht integriert wurde und andere haben ein Plasmid aufgenommen, das diese DNA enthält.

03:36 Wir täuschen die Bakterien mit dem Medium in der Schale, das Ampicillin enthält.

03:42 Hat das Bakterium das Plasmid aufgenommen, wird es eine Ampicillin-Resistenz aufweisen. Das ist das rote Gen.

03:49 Es wird auf dem Nährboden wachsen. Zum Medium fügen wir zusätzlich X-Gal hinzu.

03:57 X-Gal ist ein Zucker, der sich bei aktiver Betagalaktosidase blau färbt. Dadurch haben wir ein sichtbares Merkmal, das wir beobachten können. Die transformierten Bakterien lassen wir auf diesem Medium wachsen. Besitzen sie ein aktives lacZ-Gen, entsteht die Blaufärbung.

04:23 Haben sie kein aktives Gen, dann erscheinen die Bakterienkulturen weiß. Aus diesem Ergebnis können wir zum Einen ableiten, dass das Bakterium das Plasmid aufgenommen hat, denn sonst würden es auf dem Nährboden nicht wachsen, weil das Ampicillin es abtötet würde. Zudem wissen wir, dass es das uns interessierende Gen aufgenommen hat. An welcher Kultur in der Schale sind wir letztendlich interessiert? Uns interessieren die gelb dargestellten Bakterien, die das kaputte lacZ-Gen enthalten, da wir von diesen wissen, dass sie die jeweilige DNA aufgenommen haben. Dazu werden wir uns einige Beispiele ansehen.