Gel Electrophoresis

00:01 Nun müssen wir uns überlegen, wofür diese Restriktions Enzyme verwendet werden. Wir können rekombinante DNA herstellen.

00:08 Wir können aber auch DNA-Stücke aller möglichen Größen herstellen. Beispielsweise, um damit DNA-Fingerabdrücke zu analysieren. Diese Technik werden wir uns demnächst genauer ansehen.

00:23 Beginnen wir aber mit einer anderen Methode, unzwar der Gelelektrophorese.

00:27 Nehmen wir an, wir haben ein bakterielles Genom oder ein Pflanzengenom in Fragmente unterschiedlicher Größe zerschnitten. Diese Fragmente wollen wir sichtbar machen.

00:40 Wie können wir das tun? Wir haben eine Reaktion 1 mit einem Restriktionsenzym, das an dieser speziellen Schnittstelle schneidet. Daraus entsteht ein kurzes Fragment und ein längeres Fragment.

00:53 Durch ein anderes Restriktionsenzym haben wir eine weitere Schnittseite.

00:59 Andere Restriktionsenzyme erzeugen andere Fragmente unterschiedlicher Größe.

01:03 Stellen Sie sich vor, dass dies ein ganzes Genom ist. Wir haben sehr viele Fragmente, die durch diese Enzyme entstehen. Ein drittes Enzym könnte an einer weiteren Stelle schneiden.

01:15 So erhalten wir durch die Restriktionsendonukleasen viele Fragmente unterschiedlicher Größe.

01:20 Typ II ist durch die klebrigen Enden und die palindromischen Sequenzen charakterisiert, andere Restriktionsenzyme arbeiten mit geringerer Spezifität, schneiden aber in bestimmten Regionen. Dazu später mehr.

01:35 Wie werden die DNA-Stücke sichtbar gemacht? Gelelektrophorese ist eine Methode, die in vielen verschiedenen DNA-Technologien eingesetzt wird. Das Grundprinzip beruht darauf, dass wir in unserem Fall drei Mischungen mit unterschiedlich langen DNA-Fragmenten haben.

01:53 Die DNA können wir unter dem Mikroskop allerdings nicht sehen. Wir müssen also einen Weg finden, um diese sichtbar zu machen.

01:57 Genau das bewirkt die Gelelektrophorese. Gel wird in eine Pufferlösung gegeben und ein Strom erzeugt, der durch das Gel fließt. Wir haben also eine positiv geladene Anode und eine negativ geladene Kathode.

02:11 Die DNA ist aufgrund ihrer Struktur ziemlich negativ geladen.

02:18 In einem elektrischen Feld wandert die negativ geladene DNA in Richtung der positiv geladenen Anode. Die kleinen Fragmente können sich schneller durch das Gel bewegen als die größeren Fragmente, ähnlich wie beim Sandsieben. Sind sie an einem Fluss mit Sand und Steinen, fallen kleine Steine schneller durch ein Sieb und die größeren Steine werden zurückgehalten.

02:46 Die DNA-Moleküle wandern durch das Medium. Einige sind schneller als andere, da sich die Moleküle ihren Weg durch die Gelmatrix bahnen müssen.

03:02 Denken Sie dabei daran, dass Sie die DNA-Fragmente nicht sehen können, Führen Sie das zu lange durch, könnten alle DNA-Fragmente bis zum Ende gewandert sein. In diesem Fall hat man sich die ganze Mühe für die Visualisierung, über die wir gleich mehr erfahren werden, umsonst gemacht und es werden keine DNA-Fragmente sichtbar. Ziemlich frustrierend.

03:19 Es ist sehr wichtig, dass eine bestimmte Zeitspanne eingehalten wird, damit die Fragmente nicht über den Rand hinauswandern. Die Zeit muss allerdings lang genug sein, damit sie sich auftrennen.

03:30 Bei dieser Methode wird die DNA nach Größe getrennt. Wir verwenden die DNA-Elektrophorese oder Gelelektrophorese, um DNA-Fragmente, Proteinfragmente oder RNA-Fragmente sichtbar zu machen.

03:49 Diese Methode findet bei Molekularbiologen häufig Anwendung. Bedenken Sie, dass die DNA nicht sichtbar ist.

03:57 Sie befindet sich in unserem Gel, das Vertiefungen am oberen Rand aufweist. Unsere DNA-Fragmente haben sich nach Größe aufgetrennt. Kürzere Fragmente sind weiter gewandert, längere Fragmente weniger weit.

04:07 Wir können sie aber nicht sehen. Es gibt verschiedene Methoden, um diese sichtbar zu machen.

04:14 Die erste und einfachste Methode besteht darin die DNA mit einem fluoreszierenden Farbstoff zu markieren, der an die DNA bindet. Wir können uns dann die Fluoreszenz ansehen und die relative Lage der DNA-Banden zueinander bestimmen.

04:28 Die Gelelektrophorese ist also eine Methode, die häufig verwendet wird, um DNA-Muster, Restriktionen, Fragmentlängen, Polymorphismen, Short-tandem-Repeats, DNA-Fingerabdrücke und Ähnliches zu betrachten.